干酪乳杆菌arat基因的敲除及其对苯乳酸合成代谢的影响

苯乳酸(PLA)作为一种新型的广谱抑菌物质,在食品行业具有巨大的发展潜力,作为乳酸菌的天然代谢产物之一,对其代谢机理的研究具有非常重要的意义。通过CRISPR/Cas9基因编辑系统对一株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)1.8727的芳香族氨基转移酶基因arat进行敲除,得到一株arat缺失菌株(L.casei)1.8727Δarat。通过HPLC方法分析其代谢产物,发现发酵72 h时,PLA产量比出发菌株提高约66.7%,而苯丙氨酸(Phe)比出发菌株提高约57.8%。首次在L.casei 1.8727中成功应用基因编辑手段敲除了arat基因,研究表明该菌株具有自身合成代谢Phe的能力,arat作为PLA代谢途径的关键酶基因,其缺失并未使PLA产量下调,而是促进了PLA与Phe的合成代谢,证明干酪乳杆菌中可能存在其他的代偿途径,arat基因缺失所造成的代谢流的改变最终造成PLA与Phe产量的提高,同时PLA的合成代谢可能涉及多个基因的参与,是一个复杂的代谢网络。研究结果对于深入研究PLA的合成代谢机制具有重要意义,为后续PLA合成代谢途径提供了新的思路及方法。

天仙子中参与托品烷生物碱生物合成的ArAT基因的克隆及功能鉴定

托品烷类生物碱是临床上广泛应用的抗胆碱药物,其生物合成涉及到苯丙氨酸的转氨基反应。根据天仙子(Hyoscyamus niger)侧根和叶的转录组数据,筛选到3条功能注释为芳香族氨基酸氨基转移酶的基因,命名为HnArAT1、HnArAT2和HnArAT3。通过序列同源性分析,发现HnArAT3与颠茄的AbArAT4的氨基酸序列同源性最高,两者为直系同源。组织表达谱显示,HnArAT3基因在根中特异性表达,与其他3个合成途径基因(PMT、TRI和H6H)表达模式相同。用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法在天仙子植株中鉴定HnArAT3的功能,对感染了病毒的植株,用实时荧光定量PCR检测基因的表达量,HPLC法测定托品烷类生物碱的含量。结果表明,在pTRV2-HnArAT3干扰的植株中,HnArAT3基因的表达量有显著下降,3种托品烷类生物碱莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量也有显著的降低。以上结果表明HnArAT3是天仙子中参与托品烷类生物碱生物合成的苯乳酸支路途径基因。HnArAT3基因的克隆为进一步研究托品烷类生物碱的生物合成和代谢调控奠定了基础,也为开展托品烷类生物碱的代谢工程研究提供了新的候选靶基因。