中医“肝应春”调控机制与下丘脑褪黑素合成限速酶芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶mRNA表达相关性的研究

目的:通过观察下丘脑褪黑素合成限速酶芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶(AANAT)mRNA季节变化规律,探讨"肝应春"的调控机制,为季节性情感障碍(SAD)季节性发病的病理生理机制的认识提供实验依据。方法:选用健康雄性叙利亚金黄地鼠分别在二分二至前5周购入,在自然环境下饲养至二分二至之日,取下丘脑检测褪黑素合成限速酶AANAT mRNA表达,观察其变化规律。结果:下丘脑褪黑素合成限速酶AANAT mRNA表达水平依次为夏季组<春季组<秋季组<冬季组,其中夏季组<春季组<秋季组具有显著性差异(P<0.05),秋季组与冬季组相比,虽有秋季组低冬季组高的趋势,但差异无统计学意义。结论:①下丘脑褪黑素合成限速酶AANATmRNA表达存在着季节性的变化规律,这可能是"肝应春"调控机制之一。②SAD季节性发病规律可能与下丘脑AANAT mRNA节律性调节相关。

缺氧缺血对新生大鼠松果体芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶基因表达和血浆褪黑素水平的影响

目的了解缺氧缺血性脑损伤(HIBD)对松果体芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶(AANAT)mRNA表达和血浆褪黑素(MLT)含量的影响,探讨松果体功能改变在HIBD中的意义。方法选取7日龄SD大鼠60只随机分成HIBD模型组和假手术组。HIBD模型组按改良Levine法建立,然后用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和放免技术分别测定并比较两组缺氧缺血后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h松果体中AANAT mRNA的表达水平及血浆MLT的浓度。结果 (1)松果体中AANATmRNA的表达在HIBD后6 h、12 h、24 h低于对应假手术组(P<0.05或<0.01);假手术组各时点之间AANAT mRNA的表达水平无明显变化(P>0.05)。(2)血浆MLT浓度在HIBD后12 h、24 h均低于对应假手术组(P<0.01);假手术组各时点之间MLT浓度均无明显变化(P>0.05)。结论 HIBD早期松果体合成褪黑素的功能下降及内源性MLT保护作用的降低可能参与早期HIBD的发病。

中华按蚊电转化显微注射技术平台的构建及其在基因瞬时过表达中的应用

【目的】构建在中华按蚊 Anopheles sinensis 中的电转化显微注射技术平台,并利用该技术平台实现活体基因瞬时过表达对其进行验证,为开展系统的基因功能研究奠定基础。【方法】以CUY21EDIT Ⅱ电转仪为主体构建中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;使用同源重组法构建 EGFP 和 Bm-iAANAT 基因的瞬时过表达质粒,在中华按蚊化蛹3 h时注射该质粒进入蛹体,随即使用电转仪对注射后的蛹进行电击,待注射个体发育至化蛹39 h时,利用体视荧光显微镜观察蛹体表皮着色和发光情况,并通过荧光定量PCR检测 EGFP 和 Bm-iAANAT 的表达。【结果】构建了用于显微注射的 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40和 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A-EGFP-SV 40过表达载体。 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40注射组中华按蚊在化蛹39 h时约87.5%的个体成活并正常黑化,这其中约92.7%的个体的表皮检测到明显的绿色荧光,注射无启动子载体 PIZ-modi-EGFP-SV 40并进行电击的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体则没有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,注射组中发光个体的 EGFP 基因明显高表达。 PIZ-modi-Aepub-AANAT-T 2 A-EGFP-SV 40注射组的蛹在化蛹39 h时有80.4%个体存活,这其中92.2%的个体相对于注射无启动子载体 PIZ-modi-AANAT- T2A -EGFP-SV 40的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A -EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体黑化明显受阻,且有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,报告基因 Bm-iAANAT 和 EGFP 的表达明显提高。【结论】成功构建了在中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现报告基因在活蛹中的瞬时过表达,并产生了目的表型。这为中华按蚊功能基因组研究奠定了基础。