芸薹根肿菌遗传多样性分析

[目的]研究来自全国范围内芸薹根肿菌的遗传多样性,并探索ISSR分子标记与Williams生理小种鉴定结果之间的关系。[方法]对100条ISSR引物进行筛选,将筛选出的引物对48株根肿菌DNA进行扩增,根据扩增的多态性条带建立根肿菌聚类分析图,对根肿菌进行遗传多样性分析,并与Williams生理小种鉴定结果进行对比。[结果]100条ISSR引物中筛选出3条引物能扩增48株根肿菌DNA,获得清晰条带。ISSR聚类分析结果可将11号生理小种与其他生理小种区分开来,但不能以Williams生理小种鉴定结果标准将根肿菌完全区分开来,并且根肿菌的地理来源与其遗传距离并无相关性。[结论]该研究为利用分子手段鉴别根肿菌生理小种的研究奠定了基础。

芸薹根肿菌生理小种鉴别方法研究进展

本文综述了芸薹根肿菌生理小种鉴别方法和国际通用的根肿病生理小种鉴别系统及鉴别寄主,详细介绍了"Williams"和"ECD"根肿病鉴别系统的优缺点及适用范围,分析了分子生物学鉴定根肿病生理小种的技术,以期为抗病品种选育和持续控制根肿病提供准确的抗病鉴定方法。

无脉苔草根际优良促生菌鉴定及其作用研究

采用钼蓝比色法（molybdenum blue colorimetry,MBC）、乙炔还原法（acetylene reduction assay,ARA）及高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）测定了分离自无脉苔草根际的6株根际促生菌溶磷、固氮及分泌激素的特性,并利用16SrDNA序列分析技术对筛选出的2株优良促生菌进行鉴定。结果表明,6株促生菌的溶磷量在298.17-554.67mg/L之间,其中菌株TPRS3的溶磷能力最强（554.67mg/L）;6株促生菌中有4株具有固氮能力,固氮酶活性在170.19-456.87nmol C2H4/（mL·h）之间,菌株TPRS19的固氮能力最强,固氮酶活性为456.87nmol C2H4/（mL·h）,菌株TRPS3和TPRS12无固氮能力;6株促生菌均具有分泌植物激素的能力,其中3-吲哚乙酸（IAA）分泌量在8.20-86.36mg/L范围内,赤霉素（GA3）在26.36-135.90mg/L范围内,反-玉米素（t-Z）在9.55-141.68mg/L范围内,菌株TPRS19分泌IAA的能力最强,为86.36mg/L,菌株TPRS5分泌GA3的能力最强,为135.90mg/L,菌株TPRS2分泌t-Z的能力最强,为141.68mg/L,菌株TPRS3、TPRS5、TPRS12和TPRS19兼具分泌3种激素能力。经鉴定,菌株TPRS5为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,菌株TPRS19为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）,这2株菌有望作为研制微生物肥料的优良菌株。

芸薹根肿菌侵染过程及影响因子研究

借助水培法,观察芸薹根肿菌侵染结球白菜过程,确定芸薹根肿菌早期侵染部位及侵染时间;以结球白菜根毛被侵染数为指标,比较休眠孢子提取前处理方式、培养液p H值,孢子接种浓度、光照时间对根肿菌早期侵染的影响。结果表明：芸薹根肿菌早期侵染0~3 cm段根毛,1~2 cm段皮层,根毛与皮层均在第5天观察到游动孢子囊,皮层侵染点峰值晚于根毛。肿根腐烂、光照12 h/d、接种孢子浓度1×105个/m L、p H值4.2为芸薹根肿菌最佳侵染条件。

油菜防御酶系对芸薹根肿菌毒素诱导的响应

为探讨油菜防御酶系对芸薹根肿菌毒素诱导的响应,分别用不同体积分数(10%,25%,50%,85%,100%)的芸薹根肿菌粗毒素处理油菜幼苗,测定其对油菜叶片内过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响.结果表明,经毒素处理一定时间,POD、SOD和PPO活性均有不同程度提高,且高浓度毒素处理的酶活呈先升后降的趋势;其中POD活性在48 h时达到最大值,为对照的4.20倍;SOD和PPO活性均在72 h时达到最大值,分别为对照的1.83和7.00倍;CAT和PAL活性呈先降后升的趋势,二者均在72 h时出现活性最高峰,分别为对照的3.52和6.75倍.本试验表明,根肿菌粗毒素可诱导提高油菜叶片5种防御酶活性抵抗毒素的侵害.

我国芸薹根肿菌遗传类群分化研究

为了明确芸薹根肿菌种群分化与寄主、地理来源之间的关系,以采自我国11个省份,12个寄主上的43份芸薹根肿菌为研究对象,根据肌动蛋白(Actin)和多聚泛素蛋白(Polyubiquitin)这2个位点基因序列进行系统进化分析。结果表明,我国芸薹根肿菌的遗传变异与菌株的地理来源密切相关,可划分为2个遗传类群,其中基于Actin的遗传类群Ⅰ中菌株主要采自北京、四川、山东、河南、黑龙江、上海、陕西、海南、云南、西藏黄河中下游和南部地区,遗传类群Ⅱ中菌株主要采自辽宁、吉林、湖北、云南、西藏东北地区;基于Polyubiquitin的遗传类群Ⅰ中菌株主要采自辽宁、山东、陕西、吉林、河南、海南、云南、西藏华北地区,而遗传类群Ⅱ中菌株主要采自四川、湖北、北京、上海、黑龙江、云南、西藏华南地区。云南、西藏采集菌株在2个遗传类群均有分布。此外,同一寄主的菌株分布于各遗传类群,说明芸薹根肿菌的遗传多样性与寄主来源无关。

芸薹根肿菌的休眠孢子萌发条件的研究

以哈尔滨市阿城区白菜根肿菌的休眠孢子为试材,对其进行萌发测定,研究了不同因素对休眠孢子萌发的影响。结果表明:休眠孢子萌发的适宜温度为24℃,适宜pH为6.3;黑暗处理的休眠孢子比光照处理的休眠孢子萌发率高,分别为73.33%和12.16%,腐烂处理根肿的萌发率最高为73.33%。以上结果表明白菜根肿病容易发生在低温和偏酸性条件下。

芸薹根肿菌毒素对油菜幼苗生理性状及生长的影响

为探索芸薹根肿菌的致病作用,采用水培法研究根肿菌毒素对油菜胚根和胚芽生长、幼苗致萎性、细胞膜透性、叶绿素含量、根系活力和幼苗生长的影响。结果表明:根肿菌毒素具有明显的生物活性,能够抑制油菜胚根和胚芽的生长,且随处理时间的延长和处理浓度的增加,幼苗萎蔫级数逐渐增加。毒素的作用可使油菜细胞膜透性增加,叶绿素含量和根系活力下降,其中叶绿素b的含量随处理时间的延长表现为先上升后下降的趋势,但仍低于对照。油菜幼苗的株高和主根长随毒素浓度的提高均呈逐渐下降的趋势,在85%和100%毒素浓度胁迫下,油菜幼苗株高及主根长均显著低于对照,说明植株的生长受到明显抑制。

来源于解淀粉芽胞杆菌的芸薹根肿菌抑菌活性物质的分离与鉴定

十字花科根肿病是由芸薹根肿菌引起的较为严重的世界性病害之一,至今还无有效控制该病害的生物农药。本研究通过盆栽实验,筛选到一株解淀粉芽胞杆菌HB_26,对根肿病原菌具有60%以上的抑制活性。通过高效液相质谱(LC_MS)对活性物质进行分离纯化,根据分子量和紫外吸收光谱初步鉴定活性物质为肽类,命名为BA30。抑真菌实验证明BA30在150μg·mL-1的浓度下,对小麦赤霉和灰霉病菌有70%的抑菌活性,对蚕豆锈病和水稻纹枯病菌有50%的抑菌活性,对番茄早疫病菌有30%的抑菌活性。

芸薹根肿菌侵染早期甘蓝型油菜转录组分析

根肿病是油菜最为严重的病害之一。为探索根肿病菌和油菜互作中的抗性分子机制,采用RNA-seq技术对根肿病早期侵染中抗病品系ZHE-226(R)和感病油菜10159(S)进行转录组分析。与感病材料S相比,在0、12、48和72h 4个接种时间点,抗性材料R中共有809个基因上调表达,1082个基因下调表达。模式识别受体、几丁质酶、R基因、WRKY、水杨酸和茉莉酸等抗性相关(PRR)基因在抗病材料R和感病材料S中诱导表达并表现出不同的表达模式。抗病材料R中PRR相关基因主要表现为下调表达,R基因上调表达,水杨酸表现为前期下调后期上调表达,茉莉酸、几丁质酶和WRKY因子在R和S中均诱导表达。结果表明PRR介导的PTI(病原相关分子模式触发的免疫反应)在感病材料S中显著诱导,在抗病材料R中作用不明显;R基因介导的ETI(效应蛋白触发的免疫反应)和水杨酸介导的抗病信号途径对根肿病抗性起重要作用。

芸薹根肿菌及油菜根肿病分子检测与早期诊断

近年来芸薹根肿菌引起的根肿病已成为我国油菜的主要病害,严重影响油菜及其它十字花科作物的产量及品质。为建立一套在土壤、植物组织和种子中精准检测根肿菌的高效分子方法,利用根肿菌ITS(internal transcribed spacer)序列,设计一对特异性引物(Pb ITS1),通过PCR反应优化体系进行根肿菌的分子检测及病害评估。结果表明,该引物及方法能够特异性检测根肿菌DNA,不受土传病原真菌、细菌、线虫及寄主植物内生菌的DNA干扰。灵敏性检测表明,模板DNA最低浓度达1pg·μL^-1,土壤带菌量最低为1×10^3个孢子/g土,种子带菌量最低1×10^5个孢子/g种子。此外,该体系能够用于检测油菜及其它十字花科寄主植物(如组织、种子)和土壤类型。同时,可用于田间油菜不同生长阶段油菜根部及周围土壤的根肿菌检测。本研究建立的检测体系操作简便、适用范围广、灵敏度高、特异性强,可检测样品种类丰富,可为油菜及其它十字花科根肿病的早期诊断、流行监测与预警、综合防控等提供科学依据。

土壤pH对芸薹根肿菌侵染及病害发生的影响

通过设置不同 pH 梯度,研究土壤 pH 对根肿菌侵染及病害发生的影响。结果表明：土壤酸性时病菌侵染速度快,碱性时慢,而强酸性和碱性土壤条件则抑制孢子萌发；pH 为6.0时最有利于根肿菌休眠孢子萌发,萌发率最高,为53.96%；碱性条件可使初级原生质团变形凝结成球状,不能正常分裂或延迟形成游动孢子囊,从而不利于根肿菌侵染。白菜发病率与病情指数随 pH 升高,呈先上升后下降趋势。其中,pH 为5.0时,发病率和病情指数最高,pH 7.0～8.0时发病轻。因此,适宜的偏酸性环境条件下,通过作用于病菌休眠孢子萌发和侵染,提高病害危害程度,而中性或碱性条件干扰该过程并降低病害发生。

芸薹根肿菌SSR标记的开发及遗传多样性研究

芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)专性寄生于十字花科作物根部引起根肿病,且变异迅速。本研究利用Williams鉴别寄主系统鉴定了32株根肿菌,根据根肿菌基因组序列分析了根肿菌基因组中简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)的分布特性,并结合SSR标记开发研究了根肿菌遗传多样性。主要结果:从收集自8个省市31个地区的32株根肿菌中,鉴定出2、4、7和11号生理小种;根肿菌基因组存在3 164个SSR,即每7. 6 kb存在1个SSR。核苷酸重复类型以2和3为主,分布频率分别为45. 92%和53. 04%。从62对SSR引物中,筛选出31个多态性标记,多态率50%,平均PIC值为0. 407;聚类分析表明,同一地区的根肿菌大多聚类到一起,但同时存在变异。

芸薹根肿菌蛋白磷酸酶组的鉴定及生物信息学分析

由蛋白激酶和蛋白磷酸酶调控的蛋白质可逆磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它在信号转导、细胞周期、基因转录、代谢调控等过程中起到至关重要的作用。本研究以芸薹根肿菌e3菌株的基因组为试验数据来源,采用生物信息学方法对芸薹根肿菌全基因组蛋白磷酸酶进行了鉴定和表达分析。基于隐马尔可夫模型(Hidden markov model,HMM)搜索与SMART分析相结合,本研究在芸薹根肿菌基因组中共鉴定出54个蛋白磷酸酶基因。编码的54个蛋白磷酸酶可以进一步被分成4类,包括10个磷酸化蛋白磷酸酶(PPP),21个金属离子依赖型蛋白磷酸酶(PPM),19个酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP),4个基于天冬氨酸的蛋白磷酸酶(APP)。这54个蛋白磷酸酶的相对分子质量为10780~125140,等电点为4.43~10.45。通过信号肽和跨膜结构域分析发现在这54个蛋白磷酸酶中,PBRA_007461存在信号肽,PBRA_003636、PBRA_004449、PBRA_004464、PBRA_005270、PBRA_006854和PBRA_007201存在跨膜结构域。转录组分析结果表明这54个蛋白磷酸酶基因在不同时期差异表达,值得一提的是在休眠孢子萌发期和休眠孢子成熟期,金属离子依赖型蛋白磷酸酶基因PBRA_001085的表达量最高,说明该磷酸酶在休眠孢子发育中起到重要作用。综上所述,本研究可为芸薹根肿菌蛋白磷酸酶功能研究和根肿病防治靶标选择提供理论基础。

芸薹根肿菌致病机理的研究进展

十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌的侵染而引起,由于该病原菌存活时间长,传染性强,传播速度快,传播途径多样,以及对根肿菌的生活史和致病成灾机制认识不足,使得近期根肿病在中国的发生越来越严重。笔者从近年来芸薹根肿菌致病机理的相关研究进展入手,综述了生长素、细胞分裂素、水杨酸、茉莉酸和脱落酸等植物激素,氧化酶、芥子油苷和类黄酮、多胺等次生代谢物质的变化与芸薹根肿菌致病的关系,分析了芸薹根肿菌致病过程和十字花科植物在应对根肿菌侵入过程中的主要生理生化反应、代谢改变过程,以期对进一步揭示芸薹根肿菌致病机理研究及根肿病有效防控起到一定的参考和借鉴作用。

芸薹根肿菌活细胞PMAxx-qPCR快速定量检测方法的建立与应用

【目的】由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的十字花科根肿病是一种世界性土传病害,病原菌长期存在于土壤中,对十字花科作物造成严重威胁。改良叠氮溴化丙锭(propidium monoazide xx,PMAxx)可选择性地穿透受损的死细胞膜,并抑制死细胞DNA的实时荧光定量PCR(qPCR)扩增。本文将PMAxx与qPCR技术相结合,建立一种快速检测芸薹根肿菌活菌的方法,为根肿病的早期诊断及制定科学的防控措施提供依据。【方法】配置浓度分别为0、5、10、20、40、60μmol·L^(-1)的叠氮溴化丙锭PMA和改良叠氮溴化丙锭PMAxx,比较两种核酸染料对芸薹根肿菌死细胞DNA扩增的抑制效果,确定最佳核酸染料及工作浓度;设置光照时间分别为0、2、5、10、15和20 min,进行最佳光照时间的优化,建立芸薹根肿菌活细胞PMAxx-qPCR快速检测体系。设置芸薹根肿菌活孢子百分比为0、0.01%、0.1%、1%、10%、25%、50%、75%和100%的混合体系,验证PMAxx-qPCR体系的准确性,并应用于田间土壤样本中芸薹根肿菌活孢子的定量检测。【结果】PMAxx对芸薹根肿菌死细胞DNA的扩增抑制效果更好,当芸薹根肿菌浓度为1×10^(8)个孢子/mL,PMAxx预处理的最适终浓度为4μmol·L^(-1),最佳光照时间为10 min时,可有效地抑制死孢子DNA的扩增,仅以有活力孢子DNA为靶标选择性地扩增。利用PMAxx-qPCR技术检测已知不同活孢子比例的菌悬液样品,各样品实测孢子存活率和理论存活率之间呈正相关(R^(2)=0.992)。对田间采集的25份土壤样本,采用PMAxx-qPCR方法检测到11份样本中携带芸薹根肿菌,活细胞DNA浓度为32.35-6.97×10^(3)fg·g^(-1)。【结论】建立了基于PMAxx-qPCR的芸薹根肿菌活细胞定量检测技术,该技术具有快速、准确、灵敏的特点,解决了qPCR不能仅对活体病原菌进行准确鉴别和定量分析的问题,为制定有效的根肿病防控策略提供了依据。

芸薹根肿菌分泌蛋白PbSP1的克隆及表达特征分析

【目的】对芸薹根肿菌PbSP1进行克隆和功能分析,丰富芸薹根肿菌分泌蛋白的科学认知。【方法】通过生物信息学分析、表达动态变化和异源表达对芸薹根肿菌分泌蛋白PbSP1进行研究。【结果】通过测序分析发现,PbSP1的序列与已经公布的芸薹根肿菌e3菌株的参考基因组对应基因序列一致,且不存在内含子。生物信息学分析发现PbSP1氨基酸序列的氨基端存在一段信号肽序列,同时序列中存在4个Kazal结构域。通过酵母蔗糖酶分泌实验进一步发现,PbSP1编码的信号肽序列具有活性。通过不同阶段表达特征分析发现,PbSP1在不同时期差异表达,其中在芸薹根肿菌休眠孢子萌发期表达最为活跃。通过亚细胞定位实验发现PbSP1定位在细胞质内。【结论】PbSP1可以被芸薹根肿菌分泌到胞外,并在芸薹根肿菌休眠孢子萌发过程中发挥重要功能。

看芸薹根肿菌如何劫持植物的蔗糖?

2018年11月9日,Plant Cell杂志在线发表了波兰科学院植物遗传研究所Robert Malinowski课题组题为“芸薹根肿菌刺激植物早期韧皮部分化及诱导蔗糖转运蛋白表达”的研究论文。该论文描述了芸薹根肿菌如何通过刺激根韧皮部的分化和韧皮部特异性表达糖转运蛋白SWEET11和SWEET12,增加其向感染部位递送蔗糖的能力,从而与宿主建立长期摄食关系。

芸薹根肿菌生理小种鉴定与检测方法研究进展

根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)引起的全球性土传病害,对十字花科芸薹属作物的产量和质量构成了严重的威胁。根肿菌为专性活体寄生菌,具有强烈的生理小种分化现象,因此,对不同地区的生理小种类型进行评估,有利于芸薹属作物的抗性育种及作物栽培的整体规划。精确评估土壤中芸薹根肿菌休眠孢子的数量,有助于准确预测田块中根肿病发生的风险水平,可为后续防治方法的选择和防治效果的评估奠定基础。本文对芸薹根肿菌生理小种的鉴定以及土壤中根肿菌休眠孢子的检测和定量方法进行了简要综述,同时提出了一种有望应用于根肿菌生理小种研究的单细胞测序技术,并对重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)在根肿菌检测与定量方面的可行性进行了分析。本文旨在为根肿病的高效防控提供理论依据和方法参考,同时为根肿菌鉴定与检测方法的研究提供新的研究思路和解决方案。

十字花科作物根肿病研究进展

根肿病是由芸薹根肿菌侵染引起的一种土传病害,是制约十字花科蔬菜、油料作物高产稳产的重要因素之一。根肿病具有发病面积广、传播途径多、防治难度大等特点,除了直接导致作物减产外,根肿病病原的休眠孢子能在土壤中长时间存活,造成田块长期带菌,从而影响后续十字花科作物种植。基于国内外研究人员在根肿病病原的生活史、致病机制和根肿病综合防治等方面取得的重要研究进展,本文综述了影响休眠孢子萌发的生物因素及芸薹根肿菌的初侵染与再侵染过程,芸薹根肿菌的基因组特征与效应蛋白功能,芸薹根肿菌的生理小种鉴定,基于监测预警、农业防治、生物防治、化学防治的根肿病综合防治技术研发现状,同时探讨了当前根肿病研究中存在的问题和未来的发展方向,以期为根肿病综合防治关键技术的研发与应用提供借鉴。