异源表达芸薹生链格孢谷氨酸脱氢酶基因AbGDH提高水稻氮素利用率的研究（英文）

氮元素是植物生长发育所必需的重要元素之一。高等植物中的NADP(H)型谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)对NH4^+亲和力较低,因此植物主要通过谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合酶(GOGAT)途径吸收NH4^+。真菌等低等生物中的GDH对NH4^+亲和力较高,所以它们在对NH4^+的利用途径中起着重要作用。本研究克隆了来自芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola)的谷氨酸脱氢酶基因(AbGDH),并在水稻(Oryza sativa L. cv. Kitaake)中成功表达。体外酶活性分析表明, AbGDH对NH4^+、α-酮戊二酸和谷氨酸的K_m值分别为2.144±0.141 mmol/L、2.690±0.233 mmol/L和96.772±0.542 mmol/L。体内酶活性测定显示,与野生型相比,过表达AbGDH的水稻有更高的NH4^+亲和力和氨同化能力。此外,水培实验表明,与对照植物相比,转基因幼苗在低氮条件下植物高度和干重显著增加。这些结果说明,在水稻中异源表达AbGDH能促进α-酮戊二酸转化为谷氨酸,并在低氮条件下促进水稻的氨同化,从而提高氮素利用效率。

9种杀菌剂对芸薹生链格孢菌毒力的测定

对从西兰花花球上分离的1株菌株进行电镜的初步观察,经过形态学和分子生物学的鉴定认为该菌株为芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola);采用菌丝生长速率法研究了9种杀菌剂对芸薹生链格孢菌丝生长的抑制作用,通过毒力方程计算出EC50依次为凯泽(0.326 35μg·mL-1)<氟菌唑(0.548 36μg·mL-1)<翠泽(0.577 29μg·mL-1)<好力克(1.183 43μg·mL-1)<凯润(4.639 82μg·mL-1)<世高(8.627 8μg·mL-1)<百泰(18.372 88μg·mL-1)<达科宁(794.480 6μg·mL-1)<翠贝(872.017 4μg·mL-1),其中凯泽毒力最强,氟菌唑和翠泽对芸薹生链格孢也有较强的抑制作用。

芸薹生链格孢-粒状青霉共培养次级代谢产物及生物活性研究

目的研究芸薹生链格孢-粒状青霉共培养发酵的次级代谢产物,寻找具有生物活性的先导化合物。方法采用两种真菌共培养方式,通过LC-MS进行监控,综合应用现代色谱分离技术和波谱鉴定手段,获取并鉴定单体化合物;对单体化合物进行抗帕金森病活性评价和抑菌活性评价;运用Discovery Studio对单体化合物进行成药性预测和靶点虚拟筛选。结果与结论从共培养菌株的大米发酵物中分离得到3个四环二萜类化合物,分别为conidiogenone C(1)、conidiogenone E(2)和conidiogenone F(3)。MTT实验结果表明,化合物2能够抑制MPP^(+)对SH-SY5Y细胞的诱导损伤,EC值为4.76μmol·L^(-1);化合物1对表皮葡萄球菌具有一定的抑菌活性,MIC_(50)值为144.63μg·mL^(-1)。Discovery Studio预测结果表明,所有化合物均符合Lipinski成药性五规则;ADEMT预测结果表明,化合物2具有较好的中枢神经系统药物成药性特征;反向虚拟靶点筛选结果表明,化合物2能够选择性地结合在腺苷A_(2A)受体疏水口袋,与氨基酸残基Cys166和Ile66形成较强的氢键作用力。化合物2可开发为腺苷A受体拮抗剂,具有用作抗帕金森病先导化合物的潜在价值。

芸薹生链格孢产孢缺陷突变体的鉴定与表型分析

芸薹生链格孢侵染导致的黑斑病是十字花科蔬菜的重要病害,常造成严重的经济损失。其分生孢子对于病害的侵染循环起着重要作用,但目前对于芸薹生链格孢的产孢机制及产孢相关基因的研究较少。本研究从构建的芸薹生链格孢转化子库中筛选得到了9株产孢缺陷突变体,发现其在菌丝生长形态和孢子产量等方面明显异于野生菌。利用TAIL-PCR技术确定突变体M37的插入位点侧翼序列,研究表明,插入位点为芸薹生链格孢一个G蛋白α亚基基因(Ab G1)编码区。该研究将有助于芸薹生链格孢产孢基因和产孢机制的相关研究。

芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola)Ab10279基因的功能分析

十字花科蔬菜黑斑病主要是由芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola)引起的,通常使蔬菜产质量下降,造成严重损失。Zn_(2)Cys_(6)型锌指蛋白是真菌中特有的转录因子,参与调控真菌生长发育及胁迫应答等。本试验以芸薹生链格孢中编码Zn_(2)Cys_(6)锌指蛋白的转录因子Ab10279基因为研究对象,通过生物信息学分析发现,该基因全长1 069 bp,cDNA全长960 bp,编码319个氨基酸,含有一个GAL4锌指结构。采用基因敲除技术研究Ab10279基因的功能,结果显示Ab10279基因的缺失导致突变体在PDA培养基上生长速度高于野生菌,在MM培养基上低于野生菌,且突变体菌落为米白色;显微镜下观察,Ab10279基因缺失突变体在PDA培养基上未见分生孢子,链格出现膨大现象,在MM培养基上分生孢子链格数量增多;缺失突变体的分生孢子在24 h后萌发率降低,芽管长度和芽管分叉数增多;突变体在寄主小油菜叶片上致病性下降,病斑面积较野生菌降低40%左右,但突变体菌丝在穿透小油菜叶片后可继续生长。将Ab10279基因回补后,互补株C与野生菌表现几乎一致。

芸薹生链格孢致病缺陷突变体的筛选及初步分析

芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire)引起的黑斑病是十字花科蔬菜生产上的重要病害之一,在全球主产区都有报道。目前关于该病菌的致病机理的研究还较少。因此,查找和鉴定芸薹生链格孢致病相关基因,不仅有助于认识该类病原真菌致病的分子机制,还有助于发现病害防治新靶标。本研究从本实验室已构建的芸薹生链格孢转化子库中筛选得到了7株致病性缺陷的突变菌株。进一步利用Hi TAIL-PCR技术对插入位点的侧翼序列进行了扩增,并通过生物学分析方法进行了初步分析。相关研究结果将有助于对芸薹生链格孢致病机理的认识,为发现病害防治新靶标提供理论基础。

云南万寿菊叶斑病病原菌的鉴定与ITS序列分析

为明确云南万寿菊叶斑病病原菌种属分类地位,对采自云南蒙自的万寿菊叶斑病病叶,依据科赫法则进行分离、纯化、回接和再分离,证明获得的分离物是叶斑病的致病菌。对其形态特征和培养性状进行观察,并对核糖体DNA-ITS序列进行分析。结果表明,致病菌株在PDA培养基上呈灰褐色;分生孢子梗直立或弯曲,有隔膜;分生孢子倒棒形或卵形,有纵、横隔膜,无喙或具短喙。核糖体DNA-ITS序列与GenBank数据库芸苔生链格孢同源性高达100%。将云南万寿菊叶斑病的病原菌鉴定为芸苔生链格孢Alternaria brassicicola。

毕节市白菜黑斑病的病害研究及病原鉴定

[目的]对贵州省毕节市的白菜黑斑病进行病害分析和病原鉴定,以提出相应的预防措施。[方法]采用表面组织分离法从病叶中分离得到病原菌,并对病原菌进行培养、镜检、孢子大小测定和鉴定。[结果]显微镜镜检的病原菌特征表明,引起白菜黑斑病的病原菌是链格孢菌(Alternariasp.),病原菌的孢子大小为(15.0～38.5)μm×(7.5～13.5)μm,结合寄主和病原特征,引起白菜黑斑病的病原菌被鉴定为芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola)。[结论]芸薹生链格孢为贵州省毕节市当前白菜黑斑病的病原菌,可以通过农业措施和药剂预防来减少该病的危害。

花椰菜黑斑病病原鉴定及6种杀菌剂的室内药效测定

对甘肃省花椰菜黑斑病进行了病原菌分离、鉴定及最适生长温度和培养特性的研究,结果表明,引起花椰菜黑斑病的病原菌为芸薹生链格孢菌(A lternaria brassicicola(Schw.)Wiltsh ire);Altc-2菌株的菌丝最适生长温度为25℃,不同温度下培养特征也有一些差异。采用菌丝生长抑制法研究了6种杀菌剂不同浓度对Altc-2菌株菌丝生长抑制作用的结果表明,50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂和5%己唑醇微乳剂在供试浓度下对花椰菜黑斑病菌菌丝生长的抑制率均达90%以上,其中,5%己唑醇微乳剂稀释到50000倍时,对菌株A ltc-2的抑制率仍然达到100%。

甘蓝黑斑病病原菌鉴定及其对杀菌剂的敏感性

对江苏省甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)叶片上发生的黑斑病进行病原菌鉴定,并测试病原菌对杀菌剂的敏感性。经形态学观察,初步明确分离得到的病原菌(HB0、HB1、HB2、HB3、HB5、HB6)为链格孢属真菌。基于科赫氏法则测定病原菌致病性,发现HB1、HB3、HB6能在甘蓝叶片上致病。扩增上述3个致病菌株的核糖体DNA内转录间隔区(rDNA-ITS)、过敏原基因(Alt a1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH),得到大小为511~596 bp目的片段。多基因联合聚类分析结果显示,引起江苏省甘蓝黑斑病的病原菌为芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola)。室内毒力试验发现,在测试的8种杀菌剂中,苯醚甲环唑、咯菌腈、己唑醇、氟硅唑、戊唑醇、丙环唑、异菌脲对病原菌菌丝生长的抑制效果较好,代森锰锌对病原菌菌丝生长的抑制作用较弱。

库尔勒香梨黑头病拮抗菌的筛选和鉴定

【背景】库尔勒香梨黑头病是近年来发现的一种由芸薹生链格孢菌(Alternaria brassicicola)XL2引起的采后病症,由于其高侵染率和高腐烂率造成了极大的经济损失,目前已成为库尔勒香梨采后储运的主要防治病症之一。【目的】发掘高效的库尔勒香梨黑头病拮抗菌,探索拮抗菌株的抑菌作用,为其生物防治提供潜在资源菌。【方法】从采后健康果蔬表面分离不同微生物,采用平板对峙法,以A.brassicicola XL2为靶标菌筛选具有拮抗作用的菌株,结合形态学观察、生理生化检测和16S rRNA基因序列分析鉴定拮抗菌株分类地位;检测拮抗菌无菌滤液对A.brassicicola XL2的抑制效应,显微观察拮抗菌对A.brassicicola XL2菌丝生长的影响;验证拮抗菌发酵液在库尔勒香梨果实上的抑菌活性。【结果】从新疆油桃表面分离获得90株菌,其中菌株Y2对A.brassicicola XL2有较强拮抗作用,经鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。菌株Y2的无菌滤液对A.brassicicola XL2菌落生长具有明显抑制作用,2%的无菌滤液抑菌率达到70.96%;Y2无菌滤液造成A.brassicicola XL2菌丝扭曲变形、分枝增加、尖端出现致密结构等异常现象;Y2发酵液和无菌滤液明显抑制A.brassicicola XL2的孢子萌发;Y2发酵液在库尔勒香梨果实上具有较高抑菌活性,对库尔勒香梨病斑直径抑制率达到37.66%,深度抑制率达到42.74%。【结论】枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Y2能有效抑制A.brassicicola XL2的生长,对库尔勒香梨黑头病具有显著的生物防治效果。