异源表达芸薹生链格孢谷氨酸脱氢酶基因AbGDH提高水稻氮素利用率的研究（英文）

氮元素是植物生长发育所必需的重要元素之一。高等植物中的NADP(H)型谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)对NH4^+亲和力较低,因此植物主要通过谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合酶(GOGAT)途径吸收NH4^+。真菌等低等生物中的GDH对NH4^+亲和力较高,所以它们在对NH4^+的利用途径中起着重要作用。本研究克隆了来自芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola)的谷氨酸脱氢酶基因(AbGDH),并在水稻(Oryza sativa L. cv. Kitaake)中成功表达。体外酶活性分析表明, AbGDH对NH4^+、α-酮戊二酸和谷氨酸的K_m值分别为2.144±0.141 mmol/L、2.690±0.233 mmol/L和96.772±0.542 mmol/L。体内酶活性测定显示,与野生型相比,过表达AbGDH的水稻有更高的NH4^+亲和力和氨同化能力。此外,水培实验表明,与对照植物相比,转基因幼苗在低氮条件下植物高度和干重显著增加。这些结果说明,在水稻中异源表达AbGDH能促进α-酮戊二酸转化为谷氨酸,并在低氮条件下促进水稻的氨同化,从而提高氮素利用效率。

9种杀菌剂对芸薹生链格孢菌毒力的测定

对从西兰花花球上分离的1株菌株进行电镜的初步观察,经过形态学和分子生物学的鉴定认为该菌株为芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola);采用菌丝生长速率法研究了9种杀菌剂对芸薹生链格孢菌丝生长的抑制作用,通过毒力方程计算出EC50依次为凯泽(0.326 35μg·mL-1)<氟菌唑(0.548 36μg·mL-1)<翠泽(0.577 29μg·mL-1)<好力克(1.183 43μg·mL-1)<凯润(4.639 82μg·mL-1)<世高(8.627 8μg·mL-1)<百泰(18.372 88μg·mL-1)<达科宁(794.480 6μg·mL-1)<翠贝(872.017 4μg·mL-1),其中凯泽毒力最强,氟菌唑和翠泽对芸薹生链格孢也有较强的抑制作用。

出口萝卜种子中芸薹生链格孢的分离与鉴定

本文对酒泉出境萝卜种子上发现的链格孢菌(Alternariasp.)进行了形态学和分子生物学鉴定,根据结果,将这种链格孢鉴定为芸薹生链格孢(Alternariabrassicicola);该种病原菌是危害十字花科蔬菜种子生产的世界性病原真菌,在甘肃酒泉繁种基地过去未见报道。

芸苔链格孢菌毒素对白菜细胞膜透性、SOD酶和POD酶活性的影响

本文以白菜幼苗为材料，研究了芸苔链格孢菌毒素（ＡＢ－ 毒素） 对白菜叶片细胞膜透性及叶片内ＳＯＤ 酶、ＰＯＤ 酶活性变化的影响。结果表明，白菜叶片用ＡＢ－ 毒素处理后，细胞膜透性增大，且随处理时间的延长和毒素浓度的增加而增高。不同白菜品种用毒素处理后膜透性的改变与病菌接种的发病程度呈正相关，即电导率大的白菜品种，叶片发病也重。试验结果还发现，芸苔链格孢菌及其毒素处理白菜后，体内ＳＯＤ 酶和ＰＯＤ 酶活性的变化基本趋于一致，即处理后１２ ｈ 内急剧下降，然后（１２ ～４８ ｈ） 活性上升。而对照处理基本变化不大。可见。

芸薹链格孢致病毒素分析Ⅰ.腐败菌素B的分离提纯和结构鉴定

芸薹链格孢（Alternariabrassicae）在PD液体培养基中黑暗培养20d，过滤获得培养滤液，经乙酸乙酯萃取、45℃减压浓缩得AB-粗毒素。AB-粗毒素经HPLC分析，在λ＝206nm波长下具有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4个明显的吸收峰。组分Ⅲ的红外吸收光谱、FAB／MASS和1H-NMR与已报道的腐败菌素B基本一致，由此确定组分Ⅲ为腐败菌素B。试验发现，芸薹链格孢的培养滤液、AB-粗毒素和毒素组分Ⅲ均能造成白菜叶片黄化、萎蔫和坏死。

芸薹链格孢菌孢子萌发及附着胞形成的初步定量研究

采用常规流行学方法研究了芸薹链格孢菌的孢子萌发及附着胞形成。结果表明：一般浸入水中2 h后就有少量孢子萌发,10 h孢子萌发率可达90%以上;孢子萌发时各个细胞均可萌发形成芽管,向不同方向伸长,形成附着胞,20 h附着胞形成率可达50%以上;花粉和叶面物质对孢子萌发有促进作用;孢子抗干燥能力较弱,萌发孢子只须经4 h干燥即可完全丧失存活能力;芸薹链格孢菌孢子萌发及附着胞形成的温度范围均为10-25℃,15℃为孢子萌发及附着孢形成的最适温度,温度达40℃后孢子不再萌发。

芸苔链格孢菌种内和链格孢菌种间的酯酶同工酶比较

对链格孢菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）不同种和芸苔链格孢菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｉｃａｅ）不同菌系的１０个菌株的酯酶同工酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＩＦ－ＰＡＧＥ）和ＴＬ紫外扫描分析。试验发现，链格孢菌种间酯酶同工酶的扫描结果差异比种内菌株间要大；对来自不同地区，不同品种的芸苔链格孢菌的酯酶同工酶扫描结果表明，白帮菌系和青帮菌系间的差异大于各菌系内菌株的差异，说明白菜青帮菌系内和白帮菌系内各菌株间各自的同源性较近。可见，ＩＦ－ＰＡＧＥ技术可用来鉴定病原菌的致病小种和菌系。

芸苔链格孢产孢基物与光照条件的选择

在小麦、燕麦、玉米、高粱四种谷物培养基上进行芸苔链格孢[Alternariabrassicae(Berk.)Sacc]孢子产生的试验表明,小麦粒及玉米粒培养基是很好的产孢基物.在16天的产孢过程中,每克基物可分别得到166.75、156.65万个孢子.获得孢子期分别为达8及14天,共可诱发出4至7次.按产孢量来看,小麦粒培养基最大,但不及在玉米粒培养基产孢期长而稳定.玉米粒培养基是更合适的芸苔链格孢产孢培养基.用紫外线光灯及日光灯对培养9天的小麦粒产孢基物照射1小时以上即可明显地提高其产孢量.紫外光灯下照射2小时,日光灯下照射2～12小时产孢能力最强.用日光灯照射其产孢总量要高于紫外光灯照射.本项研究为进行白菜种质材料抗芸苔链格孢筛选提供了诱发孢子的可靠方法.

芸薹链格孢菌菌系致病力分化的研究

用４个不同抗性的大白菜做为鉴别寄主，对从全国采集的５３个芸薹链格孢菌菌株进行了致病力分化的研究。结果表明：这５３个菌系由弱至强可划分为ＡＢ１、ＡＢ２、ＡＢ３、ＡＢ４、ＡＢ５五个不同的致病类型。虽然从采集的地域或原寄主角度看，尚未表现出某些规律，但得到了其在供试材料上出现的频率。由于ＡＢ４具有较强的致病力，而在这次鉴定中出现的频率最高。

大白菜黑斑病芸薹链格孢鉴别寄主筛选的研究

采用黑龙江省各地的大白菜黑斑病芸薹链格孢 ( Alternaria brassicae ( Berk.) Sacca.) 2 2个单孢菌株 ,对国内当前生产上应用的大白菜、萝卜、甘蓝、油菜等十字花科蔬菜的品种 (其中含自交系和杂种一代 )共 51份进行苗期接种鉴定。试验结果表明 ,各品种对不同的菌株抗感反应差异明显。根据同一品种在相同条件下对不同菌株抗感反应存在差异 ,而在不同条件下对同一菌株抗感反应趋近一致 ,采用模糊聚类分析的方法 ,筛选出 5个鉴别寄主 ,它们是 ,二牛心大白菜、97- 3- 114大白菜、牡丹江一号大白菜。

芸薹链格孢毒素致病机理及钝化初步研究

AB -毒素是由芸薹链格孢产生的一种寄主选择性毒素 ,它能导致白菜叶片黄化、坏死和萎蔫 ,破坏白菜叶片细胞的光合作用 ,降低叶绿素含量 ,增大叶片细胞膜透性 ,使细胞内电解质外渗。KMnO4 、KI和K2 Gr2 O7能够钝化AB -毒素的生物活性 ,但是 ,KMnO4

芸薹链格孢致病毒素研究Ⅱ——AB-毒素对白菜叶片细胞PAL、POD、SOD活性的影响

芸薹链格孢 (Alternariabrassicae)和其毒素都能刺激白菜叶片细胞的PAL和PO活性 ,而且均有 2个活性高峰。在毒素的作用下抗病的山东四号PAL活性高峰分别出现在 12h和 48h ,PO活性高峰分别出现在12h和 6 0h ;感病的小杂 5 6PAL活性高峰分别出现在 2h和 12h ,PO只在 8h有一个明显的活性高峰。经芸薹链格孢和毒素处理后 ,白菜叶片细胞的SOD活性在某一时间阶段受到刺激或抑制 ,但没有明显的活性高峰出现。总的结果看来 ,AB -毒素和芸薹链格孢对

芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola)Ab10279基因的功能分析

十字花科蔬菜黑斑病主要是由芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola)引起的,通常使蔬菜产质量下降,造成严重损失。Zn_(2)Cys_(6)型锌指蛋白是真菌中特有的转录因子,参与调控真菌生长发育及胁迫应答等。本试验以芸薹生链格孢中编码Zn_(2)Cys_(6)锌指蛋白的转录因子Ab10279基因为研究对象,通过生物信息学分析发现,该基因全长1 069 bp,cDNA全长960 bp,编码319个氨基酸,含有一个GAL4锌指结构。采用基因敲除技术研究Ab10279基因的功能,结果显示Ab10279基因的缺失导致突变体在PDA培养基上生长速度高于野生菌,在MM培养基上低于野生菌,且突变体菌落为米白色;显微镜下观察,Ab10279基因缺失突变体在PDA培养基上未见分生孢子,链格出现膨大现象,在MM培养基上分生孢子链格数量增多;缺失突变体的分生孢子在24 h后萌发率降低,芽管长度和芽管分叉数增多;突变体在寄主小油菜叶片上致病性下降,病斑面积较野生菌降低40%左右,但突变体菌丝在穿透小油菜叶片后可继续生长。将Ab10279基因回补后,互补株C与野生菌表现几乎一致。

北京市生菜链格孢根腐病病原菌鉴定

为明确北京市生菜链格孢根腐病的病原菌种类,采用常规组织分离法分离获得病原菌,依据柯赫氏法则对病原菌进行致病力检测,并利用分子生物学技术结合形态学鉴定确定病原菌分类地位。结果显示,从生菜病样组织中分离到2种病原菌共18株,形态学鉴定结果为芸薹链格孢Alternaria brassicae和万寿菊链格孢A.tagetica,分离比例分别为55.6%和44.4%,且二者均能单独侵染生菜根部,前者致病力较后者强,亦能复合侵染。对致病菌株进行GAPDH基因的PCR扩增和测序,并建立了基于GAPDH基因序列的系统发育树,聚类分析结果与形态学鉴定结果一致,因此证实北京市生菜链格孢根腐病是由芸薹链格孢和万寿菊链格孢复合侵染所致。

环境因素对芸苔链格孢生长发育的影响

研究结果表明,芸苔链格孢(Alternaria brassicae)在0—35℃下均可萌发,最适温度15—20℃。菌丝在0—30℃下均能生长,最适温度20—25℃;孢子及菌丝的致死温度为50℃,10分钟。该菌对湿度要求较严格,相对湿度在90％以上时孢子才能萌发,最适相对湿度为98％;病菌在相对湿度达93％时可以侵染,98％以上最适。脱落后孢子曝露在室内(相对湿度约63％)经1小时萌发率下降32.4％,4小时下降80％。耐旱能力较差。一般情况下紫外光能促进该菌产孢,但是对某些菌系的促进作用不明显。过长的紫外光照射对该菌产孢不利,照射160分钟孢子萌发率下降近80％。麦芽糖、蔗糖为该菌的最佳碳源;硝态氮、有机氮是该菌的良好氮源。pH值为4—6时有利于分生孢子萌发,强酸、强碱对分生孢子萌发有抑制作用。

芸苔链格孢菌丝生长温度的研究

通过对芸苔链格孢[Alternaria brassicae(Berk.)Sacc.]17个单孢系菌丝在PDA培养基上生长温度的研究,结果表明各菌系在相同的温度下,菌丝生长的速度存在着明显的差异。经新复极差分析,其速度可分为三个等级。其间最高与最低可相差4.7倍。对该菌菌丝最适生长温度的研究表明,17个菌系的平均最适温度为25℃。但各菌株间有着明显的差异。作者根据其最适温度的高低及其对温度的敏感性,将这17个单孢系划分为6个温度型。即:不敏感低温型、敏感亚低温型、不敏感亚低温型、敏感中温型、不敏感中温型及不敏感亚高温型等。病菌温度型的划分可作为使用该类病菌进行抗病筛选时确定最适温度的参考。

芸薹生链格孢-粒状青霉共培养次级代谢产物及生物活性研究

目的研究芸薹生链格孢-粒状青霉共培养发酵的次级代谢产物,寻找具有生物活性的先导化合物。方法采用两种真菌共培养方式,通过LC-MS进行监控,综合应用现代色谱分离技术和波谱鉴定手段,获取并鉴定单体化合物;对单体化合物进行抗帕金森病活性评价和抑菌活性评价;运用Discovery Studio对单体化合物进行成药性预测和靶点虚拟筛选。结果与结论从共培养菌株的大米发酵物中分离得到3个四环二萜类化合物,分别为conidiogenone C(1)、conidiogenone E(2)和conidiogenone F(3)。MTT实验结果表明,化合物2能够抑制MPP^(+)对SH-SY5Y细胞的诱导损伤,EC值为4.76μmol·L^(-1);化合物1对表皮葡萄球菌具有一定的抑菌活性,MIC_(50)值为144.63μg·mL^(-1)。Discovery Studio预测结果表明,所有化合物均符合Lipinski成药性五规则;ADEMT预测结果表明,化合物2具有较好的中枢神经系统药物成药性特征;反向虚拟靶点筛选结果表明,化合物2能够选择性地结合在腺苷A_(2A)受体疏水口袋,与氨基酸残基Cys166和Ile66形成较强的氢键作用力。化合物2可开发为腺苷A受体拮抗剂,具有用作抗帕金森病先导化合物的潜在价值。

芸薹生链格孢产孢缺陷突变体的鉴定与表型分析

芸薹生链格孢侵染导致的黑斑病是十字花科蔬菜的重要病害,常造成严重的经济损失。其分生孢子对于病害的侵染循环起着重要作用,但目前对于芸薹生链格孢的产孢机制及产孢相关基因的研究较少。本研究从构建的芸薹生链格孢转化子库中筛选得到了9株产孢缺陷突变体,发现其在菌丝生长形态和孢子产量等方面明显异于野生菌。利用TAIL-PCR技术确定突变体M37的插入位点侧翼序列,研究表明,插入位点为芸薹生链格孢一个G蛋白α亚基基因(Ab G1)编码区。该研究将有助于芸薹生链格孢产孢基因和产孢机制的相关研究。

芸薹生链格孢致病缺陷突变体的筛选及初步分析

芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire)引起的黑斑病是十字花科蔬菜生产上的重要病害之一,在全球主产区都有报道。目前关于该病菌的致病机理的研究还较少。因此,查找和鉴定芸薹生链格孢致病相关基因,不仅有助于认识该类病原真菌致病的分子机制,还有助于发现病害防治新靶标。本研究从本实验室已构建的芸薹生链格孢转化子库中筛选得到了7株致病性缺陷的突变菌株。进一步利用Hi TAIL-PCR技术对插入位点的侧翼序列进行了扩增,并通过生物学分析方法进行了初步分析。相关研究结果将有助于对芸薹生链格孢致病机理的认识,为发现病害防治新靶标提供理论基础。