几种因素对芹菜CEL Ⅰ核酸酶提取的影响

为有效提取芹菜CEL Ⅰ核酸酶和进一步利用它建立点突变检测技术,分析了品种、器官、发育时期和提取液pH值对其提取量的影响,并以含有单个错配的DNA异质双链为底物鉴定其对错配切割的酶学活性.结果表明:不同芹菜品种和器官间CEL Ⅰ提取量的差异分别达到显著和极显著水平,在比较的3个不同品种(雪白、文图拉和泰国黄心芹)中,以品种泰国黄心芹的CEL Ⅰ提取量最高;而在测定的3种不同器官中,叶片的CEL Ⅰ提取量远远高于茎秆和根;以上海黄心芹为材料比较发育时期对提取量的影响表明,生殖生长期的CEL Ⅰ提取量明显高于营养生长期;缓冲液pH值对CEL Ⅰ提取量也有重要影响,pH 7.5缓冲液的CEL Ⅰ核酸酶提取量高于pH 5.5和pH 9.5;酶学活性鉴定显示,CEL Ⅰ核酸酶粗提物能有效地识别和切割DNA异质双链中的碱基错配.

基于毛细管电泳的TILLING实验技术的建立

CEL I内切酶特异识别并切断错配碱基,是建立TILLING实验技术平台的关键之一。本文从贵州省贵阳市当地种植的西芹中获得CEL I酶粗提物,利用一对具有已知单碱基差异的质粒作为底物验证所提CEL I酶粗提物的酶切活性,通过琼脂糖电泳和毛细管电泳对酶切产物进行检测,表明所获芹菜粗提物具有CEL I活性。本实验建立了适宜烟草TILLING实验的CEL I粗提物酶切体系:酶切温度42℃,酶切时间60 min,酶切反应总体积15μL,包括8μL PCR产物、4.5μL ddH2O、1.5μL酶切缓冲液(pH 7.5,500 mmol/L KCL,100 mmol/L Tris-Cl,15 mmol/L MgCl2)和1μL CEL I酶(稀释为原始粗提液0.05倍)。