转Vip3Aa基因的球孢白僵菌工程菌的构建及其对马尾松毛虫毒力的增效作用

根据苏云金杆菌营养期杀虫蛋白基因Vip3Aa序列设计全基因扩增引物,并在引物两端添加合适的酶切位点进行PCR扩增,纯化的PCR产物和载体pbarGPE1分别经Xho I和EcoR I双酶切、连接,构建真菌表达载体pbarGPE1-vip3Aa。将构建好的质粒经Sca I酶切线性化后,利用芽生孢子转化法转入昆虫病原真菌球孢白僵菌Bb13菌株内,得到白僵菌工程菌株Bb13V。RT-PCR结果证明Vip3Aa在工程菌株中已得到成功转录。在室内恒温25℃条件下,用喂食、喷雾以及两者相结合的方法,分别测定1×10^5、1×10^6、1×10^7、1×10^8和2×10^8孢子.mL^-1 5个不同孢子浓度下原始菌株和工程菌株对二龄马尾松毛虫的毒力。结果表明,在前4种不同浓度的处理条件下,采取3种不同的处理方式,工程菌株均比喷雾处理的原始菌株致死率提高30%以上;喷雾处理的毒力提高33.6-62.1倍;喂食处理的致死率均高于喷雾处理。在1×108孢子.mL^-1浓度下,喂食处理的致死率显著高于喷雾处理,致死中时缩短6.89 d。因此,Vip3Aa基因在转入白僵菌后得到了表达,从而赋予白僵菌可观的胃毒作用,使得工程菌对松毛虫的毒力明显增强。

冬虫夏草菌和昆虫激素对小金蝠蛾幼虫僵化、血淋巴和肠道微生物以及血淋巴化学物质的影响

【目的】冬虫夏草是由冬虫夏草菌Ophiocordycepssinensis侵染蝙蝠蛾幼虫形成的一种独特而有价值的虫菌复合体。人工栽培冬虫夏草时,将蝙蝠蛾幼虫血淋巴中的冬虫夏草菌芽生孢子诱导成为菌丝,是被感染幼虫僵化的先决条件。为探讨冬虫夏草菌和昆虫激素对小金蝠蛾Thitarodes xiaojinensis幼虫僵化、血淋巴和肠道微生物以及血淋巴化学物质的影响。【方法】将冬虫夏草菌芽生孢子(KD菌株)、芽生孢子和蜕皮激素(KD+20E)、芽生孢子和保幼激素(甲氧普林)(KD+M)、20E和M分别注射小金蝠蛾6龄幼虫,以注射无菌PBS、35%DMSO以及未注射任何物质的幼虫作为对照,测定幼虫的僵化率、血淋巴和肠道可培养微生物,以及血淋巴的关键物质(法尼醇、酪醇、麦角甾醇、蜕皮激素、保幼激素、葡萄糖、一氧化氮、海藻糖、N-乙酰葡糖胺)的含量。【结果】注射KD+M 120 d后小金蝠蛾幼虫的僵虫率显著提高。注射KD+20E的幼虫血淋巴中分离到更多细菌种类,而注射KD+M幼虫血淋巴中分离得到更多真菌种类。Pseudomonasmucidolens、Serratiaproteamaculans和Tsukammurella standjordii细菌出现于所有处理和注射PBS的幼虫血淋巴中(除了T. standjordii未出现于注射甲氧普林的幼虫血淋巴中);高频率出现的真菌种类为Cladosporium sp.、Isaria farinosa和Talaromyces sp.,这些菌株均未出现在未注射幼虫的血淋巴中。7种细菌(Carnobacteriummaltaromaticum、Flavobacterium frigidimaris、Microbacterium oxydans、P. mucidolens、Rahnella aquatilis、S. proteamaculans、T. strandjordii)和1种真菌(Apiotrichum porosum)出现于所有幼虫肠道中;C. maltaromaticum是幼虫肠道优势种;注射KD+M增加幼虫肠道真菌的可培养种类;高频率出现的真菌种类为I. farinosa和Penicilliumsp.;从幼虫肠道组织中未分离到Ophiocordycepssinensis。未注射芽生孢子、注射KD+20E的小金蝠蛾幼虫血淋巴中均未检测到N-乙酰葡萄糖胺。与对照组相比,注射芽生孢子和昆虫激素未显著改变血淋巴中法尼醇、蜕皮激素、海藻糖、一氧化氮的含量,但注射KD、KD+20E、KD+M、20E和M45d时可提升幼虫血淋巴的保幼激素含量。无论携菌与否,幼虫血淋巴中未检测到酪醇。【结论】注射冬虫夏草菌芽生孢子和昆虫激素,可影响小金蝠蛾幼虫的僵化率、血淋巴和肠道微生物种类以及血淋巴内相关化学物质的含量。研究结果为有效提高冬虫夏草人工培育过程中的幼虫僵化率,理解昆虫、真菌与昆虫激素的交互作用提供参考。