苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠延髓的保护作用

目的观察苁蓉舒痉颗粒对帕金森病(PD)模型大鼠延髓的保护作用及机制。方法将50只健康SD大鼠随机分为对照组10只和造模组40只。造模组大鼠于颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液来建立PD模型,对照组大鼠颈背部皮下注射等体积葵花油。将30只造模成功的大鼠再次随机分为模型组、苁蓉舒痉组、美多芭组各10只,分别予相应药液进行灌胃,连续干预14 d。分别于造模后和干预第7、14天进行网格实验和斜板实验;免疫组化法检测中脑黑质区TH阳性细胞数;TUNEL染色法观察延髓细胞凋亡情况;应用透射电镜观察延髓细胞线粒体形态;Western blot法检测大鼠中脑黑质区α-突触核蛋白(α-synuclein)和延髓B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC-1α)的蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠造模后和干预7、14 d后移动潜伏期明显缩短和斜板倾斜角度明显减小(P<0.05);中脑黑质区TH阳性细胞数明显减少(P<0.05);延髓细胞凋亡率明显增加(P<0.05),线粒体肿胀;中脑黑质区α-synuclein和延髓cleaved caspase-3、Bax蛋白表达明显提高(P<0.05),大鼠延髓Bcl-2、PPARγ和PGC-1α蛋白明显降低(P<0.05)。与模型组比较,苁蓉舒痉组和美多芭组大鼠干预7、14 d后移动潜伏期明显延长和斜板倾斜角度明显增大(P<0.05);黑质区TH阳性细胞数明显增加(P<0.05);延髓细胞凋亡率降低(P<0.05),线粒体结构接近正常;中脑黑质区α-synuclein和延髓cleaved caspase-3、Bax蛋白表达明显降低(P<0.05),延髓Bcl-2、PPARγ和PGC-1α蛋白明显提高(P<0.05)。结论苁蓉舒痉颗粒能减轻PD模型大鼠延髓神经细胞凋亡,这可能与改善PD模型大鼠延髓神经细胞线粒体形态,增加线粒体合成蛋白PPARγ及PGC-1α表达有关。

基于PERK-eIF2α通路探讨苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠黑质纹状体内质网应激的调节作用

目的 研究苁蓉舒痉颗粒对鱼藤酮诱导的帕金森病(PD)模型大鼠黑质纹状体内质网应激蛋白激酶样内质网激酶(PERK)-真核翻译起始因子2α(eIF2α)通路的调节作用。方法 将100只健康SD大鼠随机分为正常组33只和造模组67只,造模组采用颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳液建立PD模型,参照行为学评分标准鉴定造模成功后,随机分为模型组34只和治疗组33只。治疗组予苁蓉舒痉颗粒药液6.8 mL/(kg·d)灌胃,正常组、模型组予等量生理盐水灌胃,连续干预14 d。于灌胃第1、3、5、7、9、11、13、14天,采用平行反应监测(PRM)蛋白相对定量分析检测大鼠黑质纹状体eIF2α特异性肽段定量的变化;灌胃14 d后应用透射电镜观察3组大鼠黑质神经细胞超微结构;采用免疫组化法检测大鼠黑质PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α表达的平均光密度值。结果与正常组比较,在灌胃第13、14天模型组黑质纹状体eIF2α特异性肽段定量明显增高(P均<0.05),灌胃14 d后黑质神经细胞肿胀,内质网扩张,黑质PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α的平均光密度值增高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,治疗组在灌胃第5天黑质纹状体eIF2α特异性肽段定量明显增高(P<0.01),灌胃第13、14天时明显减低(P均<0.05),灌胃14 d后黑质神经细胞肿胀、内质网扩张等形态异常有所改善,黑质PERK、pPERK、eIF2α、p-eIF2α的平均光密度值明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论 苁蓉舒痉颗粒可能通过动态调节内质网应激PERK-eIF2α通路,起到恢复内质网稳态的作用。

基于斑马鱼模型研究苁蓉舒痉颗粒的抗帕金森病作用

目的:探索苁蓉舒痉颗粒对帕金森病斑马鱼的治疗效果及其分子机制,为苁蓉舒痉颗粒的药效学研究提供体内实验基础,以挖掘其临床价值。方法:将受精后6 h的斑马鱼胚胎随机分为对照组(1X E3养殖水处理)、模型组(750μmol 6-OHDA溶液处理)和药物组(25μg/mL苁蓉舒痉颗粒溶液处理)。从受精后0~120 h期间,每24 h检测各组斑马鱼胚胎/鱼苗出膜率、存活率,120 h时在显微镜下观察各组斑马鱼的形态发育情况,利用行为学方法对斑马鱼进行触尾实验及实时荧光定量聚合酶链式反应检测多巴胺信号通路相关基因mRNA表达的变化。结果:苁蓉舒痉颗粒能显著提高帕金森病斑马鱼的存活率(P<0.01),并减少其畸形发生率(如卵黄吸收延迟、鱼鳔发育迟缓、脊柱弯曲、心包水肿等);有效减轻多巴胺神经元的受损程度,保护大脑形态的正常发育,挽救帕金森病斑马鱼自主运动能力(P<0.05);有效提高多巴胺相关基因的转录水平,其中dat和drd2a基因的表达水平有显著提高(P<0.05),对多巴胺神经元损伤导致的帕金森病斑马鱼有一定的保护作用。结论:苁蓉舒痉颗粒可能通过调节多巴胺相关基因dat和drd2a的表达,减少多巴胺神经元的凋亡,从而提高帕金森病斑马鱼的行为反应能力和存活率,对帕金森病的症状有显著的改善作用。

苁蓉舒痉颗粒在正常与帕金森病大鼠中体内药动学的比较

目的比较苁蓉舒痉颗粒在正常与帕金森病大鼠中的体内药动学。方法大鼠随机分为正常组[皮下注射葵花油乳化液(1.5 mg/kg)]和模型组[皮下注射含鱼藤酮葵花油乳化液(1.5 mg/kg)],灌胃给予药物混悬液(10 g/kg),于0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、36 h采血,UPLC-MS/MS法测定特征效应组分(松果菊苷、芍药苷、丹酚酸B、毛蕊花糖苷、丹参酮ⅡA)血药浓度,计算主要药动学参数。结果与正常组比较,模型组松果菊苷、芍药苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA C_(max)升高(P<0.05,P<0.01),毛蕊花糖苷C_(max)降低(P<0.05);丹参酮ⅡA MRT_(0~t)升高(P<0.01),丹酚酸B MRT_(0~t)降低(P<0.01);芍药苷、丹参酮ⅡA MRT 0~∞升高(P<0.01),丹酚酸B MRT 0~∞降低(P<0.01);芍药苷、毛蕊花糖苷AUC 0~t、AUC_(0~∞)升高(P<0.01)。结论对于帕金森病状态下的大鼠,苁蓉舒痉颗粒口服吸收后进入其体循环的相对量更高,特征效应组分血药浓度、C_(max)、生物利用度明显提高,从而发挥更好的作用。

苁蓉舒痉颗粒剂的薄层色谱鉴别

目的建立苁蓉舒痉颗粒剂的薄层色谱鉴别法。方法采用薄层色谱法,针对苁蓉舒痉颗粒剂处方中的主药酒苁蓉、丹参、赤芍,以聚酰胺薄膜为固定相,甲醇-醋酸-水(2∶1∶7)为展开系统,鉴别酒苁蓉;以硅胶G为固定相,三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶8∶1∶4)为展开体系1,石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(4∶1)为展开体系2,10%硫酸乙醇为显色剂,鉴别丹参;以硅胶G为固定相,三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂,5%香草醛硫酸为显色剂,鉴别赤芍。结果三批苁蓉舒痉颗粒剂分别鉴别酒苁蓉、丹参、赤芍时,供试品在对照物相应位置上显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。本方法专属性强,重复性良好,且提示制成的颗粒剂保留了原药材的组分群。结论研究建立的苁蓉舒痉颗粒薄层色谱法可以用于该颗粒剂的定性鉴别。

苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠中脑线粒体氧化应激及自噬相关SIRT1/FoxO通路的影响

目的 探讨苁蓉舒痉颗粒对帕金森病(PD)线粒体氧化应激及自噬相关SIRT1/FoxO通路的影响。方法 采用软件随机数字法将27只健康SD大鼠分为正常组9只、造模组18只,造模组采用颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液建立PD模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组和治疗组各9只,治疗组予苁蓉舒痉颗粒溶液灌胃,正常组、模型组予等量生理盐水灌胃,连续干预14 d。分别于灌胃第1、7、14天进行爬杆实验检测爬杆实验得分;灌胃第14天大鼠麻醉后取材,免疫组化法检测中脑酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数,ELISA法检测中脑沉默信息调节因子1(SIRT1)、叉头蛋白O1(FoxO1)、FoxO3a蛋白水平,Western blot法检测中脑SIRT1、FoxO1、FoxO3a、微管相关蛋白轻链3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、LC3-Ⅱ蛋白表达,流式细胞术检测中脑活性氧(ROS)水平。结果 与正常组比较,模型组爬杆实验评分、ROS水平明显升高(P<0.01),TH阳性细胞数及SIRT1、FoxO1、FoxO3a、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,治疗组TH阳性细胞数及SIRT1、FoxO1、FoxO3a、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01),爬杆实验评分、ROS水平明显降低(P<0.01)。结论 苁蓉舒痉颗粒能改善帕金森病大鼠行为障碍,降低中脑组织ROS水平,增加自噬相关LC3-Ⅱ蛋白表达,保护中脑多巴胺能神经细胞,其保护作用可能是通过调节线粒体氧化应激及自噬相关SIRT1/FoxO通路实现的。

苁蓉舒痉颗粒治疗帕金森抑郁患者的疗效及改善睡眠质量的效果

目的:研究苁蓉舒痉颗粒治疗帕金森抑郁(PDD)的疗效及对睡眠质量的影响。方法:选取2019年3月至2020年3月三明市中西医结合医院收治的PDD患者120例作为研究对象,按照随机数字表法随机分为观察组和对照组,每组60例。对照组采用西药治疗,观察组在对照组治疗的基础上加用苁蓉舒痉颗粒治疗。比较2组的临床疗效、汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分、匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)评分。结果:观察组总有效率为71.67%高于对照组的51.67%(P<0.05);治疗12周后观察组HAMD、PSQI评分均低于对照组(均P<0.05)。2组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:苁蓉舒痉颗粒治疗PDD疗效显著,能缓解抑郁症状,改善睡眠质量,提高神经递质水平,安全性高。

苁蓉舒痉颗粒中间体总多糖的质量控制研究

目的建立分光光度比色法测定苁蓉舒痉颗粒中间体的总多糖含量。方法采用蒽酮-硫酸比色法,以无水葡萄糖为对照,在582 nm波长处测定总多糖含量,进行精密度、稳定性、重复性及加样回收率等方法学考察。结果无水葡萄糖质量浓度在3.41~27.26μg/mL范围内吸光度值呈良好的线性关系,回归方程为A=3.73×10^2C+4.47×10^2(r=0.998 8),平均回收率为98.32%(RSD=1.65%),3批苁蓉舒痉颗粒中间体的总多糖含量分别为20.48、22.04、24.81 mg/g。结论方法准确,重复性良好,可用于苁蓉舒痉颗粒中间体总多糖质量控制。

苁蓉舒痉颗粒对帕金森病患者黑质代谢物影响随机对照研究

目的评估苁蓉舒痉颗粒对帕金森病(PD)患者黑质代谢物影响的临床疗效及安全性。方法采用双中心分层随机化的方法,两中心分别将符合入组标准的PD患者30例,随机分2组,观察组15例予苁蓉舒痉颗粒加基础西药治疗,对照组15例予中药安慰剂加基础西药治疗,疗程12周。治疗前后进行国际运动障碍学会帕金森病综合评定量表(MDS-UPDRS)评分、磁共振波谱检测、肌电图检查、39项帕金森病生活质量问卷(PDQ-39)、非运动症状评定量表(NMSS)评分,并检测血尿常规、肝肾功能、心电图,记录不良反应事件。结果两中心意向性分析人群60例,安全性分析人群60例,磁共振波谱符合方案人群53例,肌电图符合方案人群45例。与本组治疗前比较,对照组治疗后MDS-UPDRSⅠ、PDQ-39及NMSS评分均降低(P<0.05);观察组治疗后MDS-UPDRS量表各部分评分及总分、PDQ-39与NMSS评分均降低,病轻侧黑质N-乙酰天冬氨酸/肌酸(NAA/Cr)值升高(P<0.05)。与对照组同期比较,观察组治疗后MDS-UPDRSⅠ、MDS-UPDRSⅢ、PDQ-39及NMSS评分均降低,病轻侧黑质NAA/Cr值升高(P<0.05)。治疗期间,对照组出现不良反应1例,观察后症状减轻至消失。与治疗前比较,所有患者的安全性指标无显著改变(P>0.05)。结论苁蓉舒痉颗粒可改善PD患者的运动症状及非运动症状,提高生活质量,提高黑质神经元活性,其治疗PD具有较好的安全性。

基于AHP-CRITIC优选苁蓉舒痉颗粒的提取工艺

通过比较层次分析法(AHP)、基于指标相关性的权重确定方法(CRITIC)、AHP-CRITIC混合加权法确定指标权重系数,并对正交试验各组指标成分(松果菊苷、丹酚酸B、芍药苷、出膏率)进行综合评分比较,优选苁蓉舒痉颗粒的提取工艺。结果显示AHP-CRITIC混合加权法科学优选出最佳提取工艺为加复方饮片6倍量水、提取2次、每次1 h,3次重复性验证试验指标成分松果菊苷、丹酚酸B、芍药苷的平均质量分数分别为0.72、9.34、5.92 mg·g^(-1),平均出膏率为47.18%。AHP-CRITIC混合加权法结合正交试验确定苁蓉舒痉颗粒的提取工艺稳定可行,可用于产业化生产。

HPLC多波长切换法同时测定苁蓉舒痉颗粒6个主成分含量

目的:建立HPLC多波长切换法同时测定苁蓉舒痉颗粒中松果菊苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹参酮ⅡA的含量。方法:采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min^(-1),柱温25℃,进样量20μL,检测波长分别为330 nm(松果菊苷和毛蕊花糖苷)、230 nm(芍药苷)、286 nm(丹酚酸B和丹皮酚)、270 nm(丹参酮ⅡA)。结果:松果菊苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹酚酸B、丹皮酚和丹参酮ⅡA质量浓度分别在18.18~181.8μg·mL-1(r=0.9998)、28.86~288.6μg·mL^(-1)(r=0.9998)、0.5760~5.760μg·mL-1(r=0.9995)、32.96~329.6μg·mL-1(r=0.9997)、31.97~319.7μg·mL^(-1)(r=0.9990)、1.120~11.20μg·mL^(-1)(r=0.9998)范围内与各峰面积呈良好的线性关系;平均回收率(n=6)分别为98.7%、99.4%、98.6%、99.0%、98.8%、99.1%,RSD分别为1.0%、0.92%、1.6%、0.85%、1.0%、1.7%;3批样品中上述各成分含量范围分别为3.571~3.702、6.692~6.911、0.071~0.089、7.343~7.947、2.201~2.259、0.041~0.055 mg·g^(-1)。结论:该方法可作为苁蓉舒痉颗粒质量标准同时测定6个主要成分的含量测定法。

基于IRE1α/JNK通路研究苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型大鼠的影响

目的:基于IRE1α/JNK通路研究苁蓉舒痉颗粒对帕金森病(parkinson′s disease, PD)模型大鼠的影响。方法:将45只雄性SD大鼠随机分成正常组、模型组和苁蓉舒痉颗粒组(5.21 g·kg^(-1)),除正常组外,其余大鼠采用连续14 d颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液(1.5 mg·kg^(-1))(按1.51将鱼藤酮、葵花油配为鱼藤酮葵花油乳液)制备PD模型,连续给予相应的药物14 d。免疫组化法检测大鼠脑黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)表达;Western Blot法检测大鼠脑额叶中IRE1α、JNK蛋白及其磷酸化的表达。结果:与模型组比较,苁蓉舒痉颗粒组大鼠脑黑质TH阳性细胞数明显增加(P<0.05),脑额叶p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK水平明显降低(P<0.05)。结论:苁蓉舒痉颗粒通过增加大鼠脑黑质TH阳性细胞数,降低脑额叶p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK水平来保护神经细胞,可能与IRE1α/JNK通路有关。

苁蓉舒痉颗粒HPLC-PDA全波长最大值特征图谱研究

目的探究HPLC-PDA全波长最大值法建立苁蓉舒痉颗粒特征图谱,为评价其整体质量提供依据。方法采用HPLC-PDA 210~800 nm全波长最大值法检测,Agilent Zorbax Eclipse XDB-C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为25℃,进样量为20μL,洗脱时间为60 min,PDA最大值显示谱图。结果建立了以丹酚酸B为参照峰的苁蓉舒痉颗粒HPLC-PDA全波长最大值法特征图谱共有模式,确定了20个共有特征峰并归属标定其中6个特征峰;分析的10批苁蓉舒痉颗粒与共有模式之间具有良好的相似性,相似度均>0.950。结论首次建立的HPLC-PDA全波长最大值法特征图谱,重复性好,灵敏度高,可更精准地提取并表征苁蓉舒痉颗粒效应组分群的信息,为苁蓉舒痉颗粒质量标准的制订奠定了基础,为复杂体系的中药复方制剂特征图谱的建立提供了一种可供借鉴的新方法。

苁蓉舒痉颗粒对帕金森病模型小鼠额叶PPAR-γ/PGC-1α通路的影响

目的探究苁蓉舒痉颗粒对PD模型小鼠额叶保护作用及其机制。方法腹腔注射MPTP复制PD模型。实验分组为正常组、模型组、苁蓉组和美多芭组。在造模第7天、给药14天后,对小鼠进行行为学测试;免疫组化检测小鼠黑质TH阳性细胞的表达;透射电镜观察小鼠额叶线粒体损伤情况;qPCR检测小鼠额叶中PPARγ和PGC-1αmRNA含量的表达;Western Blot检测小鼠额叶中TFAM、PPAR、NRf2、PGC-1α蛋白的表达。结果(1)行为学:造模7d后,与正常组比较,模型组悬挂、爬杆评分、抓力值、自主活动次数降低,给药治疗14d后,与模型组比较,苁蓉组、美多芭组悬挂、爬杆得分、自主活动次数增加。(2)免疫组化:与正常组比较,模型组小鼠黑质TH阳性细胞数明显减少;与模型组比较,苁蓉组、美多芭组小鼠黑质TH阳性细胞数明显增多。(3)透射电镜:与正常组比较,模型组额叶线粒体出现肿胀、空泡样,嵴断裂甚至消失;与模型组比较,苁中组与美多芭组额叶线粒体数量有所增加,形态有所改善。(4)qPCR:与正常组比较,模型组小鼠PPARγ、PGC-1αmRNA表达水平明显降低;与模型组比较,苁蓉组、美多芭组小鼠PPARγ、PGC-1αmRNA表达水平明显升高。(5)Western Blot:与正常组比较,模型组TFAM、PPAR、NRf2、PGC-1α蛋白表达量明显降低;与模型组比较,苁蓉组、美多芭组蛋白表达量明显升高。结论苁蓉舒痉颗粒可以减少PD模型小鼠额叶损伤,这种保护作用可能是通过调节PPAR-γ/PGC-1α通路实现。