苏云金芽胞杆菌苏云金素缺失突变株的筛选及特性研究

利用高温和SDS对苏云金素高产菌株CT-43-1c进行了质粒消除,筛选得到一株不产苏云金素的无晶体突变株BMB0806;并通过SDS-PAGE、高效液相色谱(HPLC)和脉冲电泳(PFGE)分析了野生型菌株CT-43、出发菌株CT-43-1c和突变株BMB0806杀虫晶体蛋白的组成、苏云金素的产量和质粒图谱之间的差异.结果表明,突变株BMB0806与菌株CT-43和CT-43-1c相比,分别缺失了3个和2个大质粒,从而不再产生苏云金素和由cry1B基因编码的分子量为140×103的杀虫晶体蛋白.进一步分析三者质粒图谱后发现,突变株BMB0806中苏云金素的缺失和cry1B基因所在的大质粒A直接相关.

5%苏云·茚虫威悬浮剂复配酰胺类药剂对稻纵卷叶螟田间防治效果

针对目前酰胺类药剂单独使用防治稻纵卷叶螟的田间效果下降,不能较好地满足水稻绿色防控需求,通过田间试验,研究了5%苏云·茚虫威悬浮剂与酰胺类药剂混用对稻纵卷叶螟的田间防效、适宜用量及安全性,以期为水稻绿色防控提供科学依据。结果表明,用5%苏云·茚虫威悬浮剂375.0 mL/hm^(2)+10%四氯虫酰胺悬浮剂375.0 mL/hm^(2)、5%苏云·茚虫威悬浮剂375.0 mL/hm^(2)+6%阿维·氯苯酰悬浮剂450.0 mL/hm^(2)对稻纵卷叶螟的防治效果较好,药后3 d保叶效果分别为84.12%和86.74%,杀虫效果分别为100.00%和98.38%;药后7 d保叶效果均达到84%以上,杀虫效果分别为95.71%和92.84%;药后14 d保叶效果分别为81.39%和82.21%,杀虫效果分别为96.00%和90.68%。

苏云金素高产菌株的选育

用硫酸二乙酯(DES)处理苏云金杆菌CT-43菌株,得到了菌落形态、菌形和产生褐色素三种类型的突变株。光滑型(S-型)菌落自发突变的比例依亚种的不同而不同,CT-43菌株高达13.0％,苏云金亚种为10.6％,以色列亚种为3.9％,库斯塔克亚种不产生S-型菌落,S-型菌落依DES处理CT-43菌株芽孢时间的延长而增加,处理90分钟达49.0％。除个别S-型菌落外,均不产生苏云金素。诱变产褐色素菌落的频率为1.4％,它们都不产苏云金素。菌形变异株有仅芽孢,仅伴孢晶体,芽孢和伴孢晶体,营养体和芽孢,营养体和伴孢晶体,营养体、芽孢和伴孢晶体发生变异六种类型,它们产生苏云金素的水平各不相同。还获得了苏云金素产量比出发菌株明显提高的二个菌株。

苏云金素在水中和植株上的衰减与残留

用HPLC检测了苏云金素在鱼塘水和清水中的衰减速率。清水中该物质的半衰期长达433小时；在鱼塘水中苏云金素的衰减呈双指数消除模型，开始消除半衰期为2．43～10.68小时，终未消除半衰期为128．57～142．01小时。该物质在水稻植株内的消除模型为单指数消除模型C=73．21e－0.0038t；t1／2为182．36小时。在水稻分蘖期大剂量喷药后稻米中无苏云金素残留。苏云金素在夏季小白菜上的开始消除半衰期t1／2a为59．74小时，终末消除半衰期t1／2β为382.89小时；在冬季小白菜上t1／2为330小时。苏云金素制剂在小白菜上施用之后很可能残留到采收食用时。

苏云金素测定方法的研究

用黄色八叠球菌、金色微球菌、根癌农杆菌和萤光假单胞杆菌作指示菌，同时用家蝇幼虫作指示昆虫，对产苏云金素的４株苏云金杆菌发酵物的毒力进行了测定。结果表明，两种测定方法所获得的抑菌圈大小与校正死亡率成正相关，但微生物测定法要快速、省材。尤其是用黄色八叠球菌为指示菌的微生物测定法比用其它几种指示菌时所出现的抑菌圈要清晰、透明，容易测定。选用这一指示菌来测定苏云金杆菌所产的苏云金素是可行的。

高产苏云金素培养基和培养条件的优选

用正交试验的方法筛选了苏云金杆菌高产苏云金素的培养基配方和培养条件。在第一次正交试验筛选出的6种培养基配方的基础上,对培养基成分和用量作调整后进行第二次正交试验,筛选出五种培养基配方。将这11种培养基用3个菌株继续评选,尽管不同菌株在同一培养基中产苏云金素的量不同,但3个菌株产苏云金素量最高,且稳定的培养基匀为M_3培养基。正交试验的最后培养条件:温度32℃、pH6.5、通气量最大,转速200rpm、接种菌龄16小时、接种量3％、培养24小时。同时,还对苏云金菌杆CT—43菌株在培养基M_3中不同发酵时间的细胞数、pH、还原糖、氨态氮和可溶性磷以及苏云金素的杀虫活性进行了检测。

应用高压液相色谱测定苏云金杆菌发酵液中的苏云金素

通过正交试验将测定苏云金素所用的HPLC流动相确定为:0.075M磷酸二氢钾水溶液,加1％甲醇并用磷酸调pH至2.5。所选定的色谱条件可保证苏云金素的分离度为100％。苏云金素浓度从0.6μg/ml至900μg/ml,其峰面积与素的含量之间呈很好的直线关系。苏云金素的最低检出量为2.25×10^(-3)ng。用发酵样品进行测定,不同浓度素的峰面积对数与生测的试虫死亡机率值之间的相关系数为0.998。以HPLC法和昆虫生测法同时测定结果各重复间的变异系数(C.V.)为0.2～1.5％,测出浓度与实际浓度的平均不符合率为2.4％;昆虫生测法的测定结果各重复间的变异系数为14.6～16.2％,测出浓度与实际浓度的平均不符合率为17.0％。用这两种方法同时测定了3个苏云金素发酵样品中素的浓度,两种方法所得结果的平均符合率为86.84％。

液相色谱(HPLC)快速测定苏云金素的方法

苏云金素(thuringiensin)是苏云金杆菌(Bdcillus thuringiensis)分泌到菌体外的核苷类细菌杀虫素,亦有B—外毒素,热稳定外毒素,蝇固素(或蝇毒素)之称。它是仅次于苏云金杆菌产生的伴孢晶体蛋白毒素的另一类有应用价值的毒素。

苏云金素对昆虫细胞株的毒力试验

苏云金杆菌伴孢晶体毒素对昆虫细胞株的毒性以及用昆虫细胞株测定伴孢晶体毒素的含量,国内外都发表了一些研究报告,并有所进展。然而,苏云金素对昆虫细胞株的毒性尚未见这方面的报告,本文将简报这一研究结果。

苏云金芽胞杆菌产苏云金素菌株CT-43及其缺失突变株的差异蛋白

【目的】苏云金素(Thuringiensin)的合成和代谢途径的相关研究在国内外一直进展缓慢,本文拟从蛋白质组水平揭示与苏云金素合成或代谢相关的蛋白。【方法】利用双向电泳技术研究了高产苏云金素的苏云金芽胞杆菌野生菌株CT-43、其高产突变菌株CT-43-1C及不产突变菌株BMB0806在蛋白表达水平的差异,然后对差异蛋白点进行质谱鉴定,最后对鉴定出的蛋白进行生物信息学分析。【结果】与野生型和高产菌株相比,在BMB0806中发现了13个差异显著的蛋白点,鉴定出了其中的9个,生物信息学结果显示有6个蛋白可能与苏云金素合成或代谢相关。【结论】通过蛋白质组研究找到了6个可能与苏云金素合成或代谢相关的蛋白,为苏云金素合成基因簇的克隆和合成途径的验证提供了有力的证据。

苏云菌芽胞杆菌毒蛋白基因导入甘蓝获得抗虫转基因植株

苏云菌芽胞杆菌（Ｂｔ）毒蛋白对鳞翅目等昆虫有良好的特异性抗虫效果，转Ｂｔ基因为害虫防治和环境保护开辟了一条全新的途径。本试验采用根癌农杆菌介导的方法，成功地将Ｂｔ毒蛋白基因ＧＦＭＣｒｙＩＡ导入到甘蓝中，并获得了抗虫转基因植株。１材料与方法１．１植物...

苏云金芽孢杆菌高效价杀虫剂的研究进展

苏云金芽孢杆菌制剂是目前应用广泛而有效的一种微生物杀虫剂。本文从菌种分离筛选、构建遗传工程菌、突变筛选及定向进化等方面介绍了获得苏云芽孢金杆菌高效价杀虫的几种研究策略,并对各种策略的进展及应用前景进行了简要综述。

苏云金素发酵培养基的优化设计

采用Plackett-Burman设计对出发培养基各种成分影响苏云金芽孢杆菌中华亚种CT43发酵合成苏云金素的效应进行评价,筛选出有显著影响效应的因素为葡萄糖和黄豆饼粉。利用最陡爬坡路径试验逼近最大苏云金素产出区域,找到后续试验中心点。综合中心组合设计和响应面分析法确定显著因素的最佳浓度。优化后培养基组成为(g/L):葡萄糖22.8g、黄豆饼粉32.5g、酵母抽提物3.0g、蛋白胨4.5g、玉米浆3.0g、KH2PO42.0g、MgSO4.7H2O 0.15g、MnSO4.H2O0.02g,苏云金素产量可达3.2g/L,比出发培养基提高2倍以上。

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的研究进展

从Bt基因的分类、结构和特性、杀虫机理、在农业上的应用及昆虫对Bt产生抗性的机制等方面进行了论述。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种P19基因的初步研究

以含有Ｐ１９和ｃｙｔ１Ａ基因的以色列亚种７２ＭＤ质粒的９７ｋｂＨｉｎｄⅢ片段为模板进行ＰＣＲ扩增，分别获得Ｐ１９基因和ｃｙｔ１Ａ基因片段。与表达载体ｐＵＨＥ２４连接转化大肠杆菌ＸＬ１，获得３个克隆株。ＬＺ１９含有Ｐ１９基因；ｐＬＺｃｙｔ１Ａ含有ｃｙｔ１Ａ基因；ＬＺ１９Ａ含有Ｐ１９和ｃｙｔ１Ａ两个基因。利用ｃｙｔ１Ａ蛋白质可使大肠杆菌细胞致死的特性，在ＩＰＴＧ诱导下，测定了各克隆基因表达对大肠杆菌有致死作用；ｐＬＺ１９Ａ对大肠杆菌的起始致死作用明显快于ｐＬＺｃｙｔ１Ａ，这种现象可能是Ｐ１９基因促进ｃｙｔ１Ａ基因高表达的结果。

苏云金素对智利小植绥螨及其猎物二斑叶螨的毒力测定

苏云金素处理后第3天智利小植绥螨和二斑叶螨幼螨的LC_(50)分别为211.33μg/ml和114.58μg/ml。两种雌成螨的产卵量第2天即明显减少,高剂量处理后3～4天,导致产卵停止。处理后第5天,智利小植绥螨和二斑叶螨成螨的LC_(50)分别为843.19μg/ml和279.88μg/ml。试验结果表明,苏云金素对两种幼螨是一种高效、无选择性的杀螨剂,对智利小植绥螨的卵和成螨毒性相对较低,但能抑制其雌成螨的产卵量,降低种群趋势指数,在释放智利小植绥螨期间应尽量避免用药。

苏云金素对几种农林卫生害虫的杀虫活性

在室内用加毒饲料或沾毒叶片喂饲等感染方法，分别测定了苏云金素对鞘翅目、鳞翅目、双翅目和同翅目等１４种农林卫生害虫的毒力。结果表明苏云金素对所试昆虫的幼虫均有一定的毒杀或抑制作用，其ＬＣ＿（５０）值从０．６３８μｇ／ｍｌ至６０３．２２μｇ／ｍｌ不等，因试虫种类、虫龄而异。苏云金素对玉米象和前２８星瓢虫成虫毒力较低，对玉米象的ＬＣ＿（５０）为４１０．５２μｇ／ｍｌ；以５０～４５０μｇ／ｍｌ浓度感染２８星瓢虫成虫，死亡率仅４～３２％，其产卵量明显低于对照组，但对卵的孵化率没有影响。

甜核·苏云菌制剂防治水稻大螟技术初探

为了寻找防治水稻大螟的理想药剂,开展了甜核·苏云菌不同配比对不同时期的大螟田间防治的技术研究。田间试验表明,武汉武大绿洲生物技术有限公司生产的甜核·苏云菌(高端)产品对水稻大螟具有较好的防治效果,而且持效期长。在水稻大螟卵孵至2龄幼虫高峰期用药,用量为450 g/hm^2时,该药剂保苗效果和杀虫效果均可达到90%以上,且对水稻生产安全。

苏云金芽孢杆菌工程菌BM B_(20-4)的杀虫晶体蛋白检测及毒力测定

苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白由单基因编码,经过遗传操作,构建成BM B 20-4工程菌.本研究对工程菌BM B 20-4进行了杀虫晶体蛋白检测和发酵液毒力测定.结果表明:工程菌BM B 20-4杀虫晶体蛋白质含量比天然菌株提高44%,毒力效价显著提高,对小菜蛾提高了0.72倍,对棉铃虫提高了0.75倍.