表达蝎毒素AaIT或苏云金杆菌毒素Cyt2Ba的大肠埃希菌杀蚊幼活性及增效剂型测试

目的构建表达蝎毒素AaIT或苏云金杆菌毒素Cyt2Ba的大肠埃希菌,检测重组菌对致倦库蚊和白纹伊蚊II龄幼虫的毒力,并测试不同剂型的增效作用。方法分别将AaIT和Cyt2Ba编码基因克隆于pET28a(+)质粒上,并将重组质粒分别转化BL21 E.coli获得分别表达AaIT和Cyt2Ba的工程菌株,经IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白的表达;测试不同浓度工程菌菌液对于蚊幼虫的杀灭效果;并将有效的工程菌制成干粉剂,检测其干粉末及其配剂对蚊幼虫的杀灭效果。结果 AaIT和Cyt2Ba重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,但AaIT重组蛋白对蚊幼虫不具有毒性。表达Cyt2Ba重组蛋白的工程菌菌液对白纹伊蚊和致倦库蚊幼虫均具有明显的杀灭作用,48 h的LC50分别为3.00×106和1.25×107cells/m L,其中对白纹伊蚊幼虫的杀灭效果要显著优于对致倦库蚊幼虫的杀灭效果(P<0.001),并且表达Cyt2Ba重组蛋白的工程菌干粉末及其配剂均具有较好的杀蚊幼虫效果。当该工程菌干粉末与干酵母粉、小麦粉和白胡椒粉分别按4∶1、1∶1和1∶4比例制成配剂处理蚊幼虫48 h后,结果显示当质量比为1:1时,配剂杀蚊幼效果显著提高(P=0.044),并且白胡椒粉末配剂效果要显著好于干酵母粉和小麦粉配剂(P=0.002)。结论表达Cyt2Ba的重组大肠埃希菌对蚊幼虫具有较好的杀灭作用,合适配剂的使用可以增强其在蚊虫防制中的效果。

家蚕对苏云金芽孢杆菌毒素Cry1Ac的抗性遗传分析

害虫对杀虫剂的抗性遗传特性是农林业害虫防治体系中制定抗性治理对策的重要依据。以鳞翅目昆虫家蚕作为模型,研究害虫对微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌(Bt)毒素的抗性遗传特性。在调查100个家蚕品系对Bt毒素Cry1Ac的抵抗能力的基础上,运用经典的杂交和回交方法,以家蚕抗性品系ACR1(R,LC50>375 mg/L)和敏感品系Nistari(S,LC50=37.5 mg/L)为亲本建立正反交F1、自交F2及回交BC1群体,进一步分析家蚕对Bt毒素Cry1Ac的抗性遗传模式。通过对供试家蚕群体2龄幼虫添食Bt毒素Cry1Ac后24 h的死亡与存活表型分离数据进行统计分析,最终确定家蚕抗性品系ACR1对Bt毒素Cry1Ac的抗性由隐性单基因控制。

几株Bt菌株对紫外线的抗性探讨

采用不同照射时间的紫外光 (UV)对 1株野生型Bt菌株及 3株Bt菌株Bt0 0 1、Bt2 0 0、Bt0 87进行照射处理后再置于双碟上培养 16h ,结果表明 ,Bt野生菌株在UV处理 3min后已基本全部失活 ,而Bt0 0 1、Bt2 0 0、Bt0 87在UV处理 8min后仍有活性。从UV处理时间的长短及平板上出现菌落数的多少得知 ,尽管菌株Bt0 0 1、Bt2 0 0、Bt0 87对UV的抗性都比野生Bt菌株强得多 ,但并不相等。其中 ,Bt2 0 0相对弱些 ,UV处理 9min后已无菌落 ;Bt0 87最弱 ,UV处理 8min后已无菌落 ;而菌株Bt0 0 1对UV的抗性最强 ,UV处理 13min后仍有菌落出现。这说明不同的Bt菌株 ,其遗传背景是不同的。另外 ,Bt0 0 1经紫外线照射 9min ,培养 16h后发现有 9个菌落发生明显的变异 ,菌落呈棕黄色 ,菌落明显比原始菌落小。涂片 ,油镜下观察其菌体要比原始菌体小 。

高效生物杀虫剂BtA化学耦合技术研究

提出了苏云金芽胞杆菌毒蛋白与阿维菌素化学耦合的方法 ,实现了多位点生物杀虫毒素 Bt A的工业化生产。认为 Bt A的化学耦合 ,一方面是将 Bt的伴胞晶体进行酶切改造 ,形成带末端氨基的原毒素 ,另一方面是将放线菌的杀虫毒素阿维菌素通过对 C2 3 位置上的羟基进行激活、衍生化 ,形成带羧基的阿维菌素衍生物 ,最后利用氨基 -羧基耦联剂 EDC进行耦合 ,实现单体双生物毒素 Bt A的结构改造。高效生物杀虫剂 Bt A的研究成功 ,使其杀虫谱扩大为五个目 (鳞翅目、同翅目、双翅目、鞘翅目和螨类 ) ,杀虫速率提高为 >85 %死亡率 /2 4小时 ,保持了无公害的特性 。