苏云金素发酵培养基的优化设计

采用Plackett-Burman设计对出发培养基各种成分影响苏云金芽孢杆菌中华亚种CT43发酵合成苏云金素的效应进行评价,筛选出有显著影响效应的因素为葡萄糖和黄豆饼粉。利用最陡爬坡路径试验逼近最大苏云金素产出区域,找到后续试验中心点。综合中心组合设计和响应面分析法确定显著因素的最佳浓度。优化后培养基组成为(g/L):葡萄糖22.8g、黄豆饼粉32.5g、酵母抽提物3.0g、蛋白胨4.5g、玉米浆3.0g、KH2PO42.0g、MgSO4.7H2O 0.15g、MnSO4.H2O0.02g,苏云金素产量可达3.2g/L,比出发培养基提高2倍以上。

苏云金芽胞杆菌苏云金素缺失突变株的筛选及特性研究

利用高温和SDS对苏云金素高产菌株CT-43-1c进行了质粒消除,筛选得到一株不产苏云金素的无晶体突变株BMB0806;并通过SDS-PAGE、高效液相色谱(HPLC)和脉冲电泳(PFGE)分析了野生型菌株CT-43、出发菌株CT-43-1c和突变株BMB0806杀虫晶体蛋白的组成、苏云金素的产量和质粒图谱之间的差异.结果表明,突变株BMB0806与菌株CT-43和CT-43-1c相比,分别缺失了3个和2个大质粒,从而不再产生苏云金素和由cry1B基因编码的分子量为140×103的杀虫晶体蛋白.进一步分析三者质粒图谱后发现,突变株BMB0806中苏云金素的缺失和cry1B基因所在的大质粒A直接相关.

苏云金素对智利小植绥螨及其猎物二斑叶螨的毒力测定

苏云金素处理后第3天智利小植绥螨和二斑叶螨幼螨的LC_(50)分别为211.33μg/ml和114.58μg/ml。两种雌成螨的产卵量第2天即明显减少,高剂量处理后3～4天,导致产卵停止。处理后第5天,智利小植绥螨和二斑叶螨成螨的LC_(50)分别为843.19μg/ml和279.88μg/ml。试验结果表明,苏云金素对两种幼螨是一种高效、无选择性的杀螨剂,对智利小植绥螨的卵和成螨毒性相对较低,但能抑制其雌成螨的产卵量,降低种群趋势指数,在释放智利小植绥螨期间应尽量避免用药。

苏云金素高产菌株的选育

用硫酸二乙酯(DES)处理苏云金杆菌CT-43菌株,得到了菌落形态、菌形和产生褐色素三种类型的突变株。光滑型(S-型)菌落自发突变的比例依亚种的不同而不同,CT-43菌株高达13.0％,苏云金亚种为10.6％,以色列亚种为3.9％,库斯塔克亚种不产生S-型菌落,S-型菌落依DES处理CT-43菌株芽孢时间的延长而增加,处理90分钟达49.0％。除个别S-型菌落外,均不产生苏云金素。诱变产褐色素菌落的频率为1.4％,它们都不产苏云金素。菌形变异株有仅芽孢,仅伴孢晶体,芽孢和伴孢晶体,营养体和芽孢,营养体和伴孢晶体,营养体、芽孢和伴孢晶体发生变异六种类型,它们产生苏云金素的水平各不相同。还获得了苏云金素产量比出发菌株明显提高的二个菌株。

苏云金素在水中和植株上的衰减与残留

用HPLC检测了苏云金素在鱼塘水和清水中的衰减速率。清水中该物质的半衰期长达433小时；在鱼塘水中苏云金素的衰减呈双指数消除模型，开始消除半衰期为2．43～10.68小时，终未消除半衰期为128．57～142．01小时。该物质在水稻植株内的消除模型为单指数消除模型C=73．21e－0.0038t；t1／2为182．36小时。在水稻分蘖期大剂量喷药后稻米中无苏云金素残留。苏云金素在夏季小白菜上的开始消除半衰期t1／2a为59．74小时，终末消除半衰期t1／2β为382.89小时；在冬季小白菜上t1／2为330小时。苏云金素制剂在小白菜上施用之后很可能残留到采收食用时。

苏云金素测定方法的研究

用黄色八叠球菌、金色微球菌、根癌农杆菌和萤光假单胞杆菌作指示菌，同时用家蝇幼虫作指示昆虫，对产苏云金素的４株苏云金杆菌发酵物的毒力进行了测定。结果表明，两种测定方法所获得的抑菌圈大小与校正死亡率成正相关，但微生物测定法要快速、省材。尤其是用黄色八叠球菌为指示菌的微生物测定法比用其它几种指示菌时所出现的抑菌圈要清晰、透明，容易测定。选用这一指示菌来测定苏云金杆菌所产的苏云金素是可行的。

高产苏云金素培养基和培养条件的优选

用正交试验的方法筛选了苏云金杆菌高产苏云金素的培养基配方和培养条件。在第一次正交试验筛选出的6种培养基配方的基础上,对培养基成分和用量作调整后进行第二次正交试验,筛选出五种培养基配方。将这11种培养基用3个菌株继续评选,尽管不同菌株在同一培养基中产苏云金素的量不同,但3个菌株产苏云金素量最高,且稳定的培养基匀为M_3培养基。正交试验的最后培养条件:温度32℃、pH6.5、通气量最大,转速200rpm、接种菌龄16小时、接种量3％、培养24小时。同时,还对苏云金菌杆CT—43菌株在培养基M_3中不同发酵时间的细胞数、pH、还原糖、氨态氮和可溶性磷以及苏云金素的杀虫活性进行了检测。

应用高压液相色谱测定苏云金杆菌发酵液中的苏云金素

通过正交试验将测定苏云金素所用的HPLC流动相确定为:0.075M磷酸二氢钾水溶液,加1％甲醇并用磷酸调pH至2.5。所选定的色谱条件可保证苏云金素的分离度为100％。苏云金素浓度从0.6μg/ml至900μg/ml,其峰面积与素的含量之间呈很好的直线关系。苏云金素的最低检出量为2.25×10^(-3)ng。用发酵样品进行测定,不同浓度素的峰面积对数与生测的试虫死亡机率值之间的相关系数为0.998。以HPLC法和昆虫生测法同时测定结果各重复间的变异系数(C.V.)为0.2～1.5％,测出浓度与实际浓度的平均不符合率为2.4％;昆虫生测法的测定结果各重复间的变异系数为14.6～16.2％,测出浓度与实际浓度的平均不符合率为17.0％。用这两种方法同时测定了3个苏云金素发酵样品中素的浓度,两种方法所得结果的平均符合率为86.84％。

液相色谱(HPLC)快速测定苏云金素的方法

苏云金素(thuringiensin)是苏云金杆菌(Bdcillus thuringiensis)分泌到菌体外的核苷类细菌杀虫素,亦有B—外毒素,热稳定外毒素,蝇固素(或蝇毒素)之称。它是仅次于苏云金杆菌产生的伴孢晶体蛋白毒素的另一类有应用价值的毒素。

苏云金素对几种农林卫生害虫的杀虫活性

在室内用加毒饲料或沾毒叶片喂饲等感染方法，分别测定了苏云金素对鞘翅目、鳞翅目、双翅目和同翅目等１４种农林卫生害虫的毒力。结果表明苏云金素对所试昆虫的幼虫均有一定的毒杀或抑制作用，其ＬＣ＿（５０）值从０．６３８μｇ／ｍｌ至６０３．２２μｇ／ｍｌ不等，因试虫种类、虫龄而异。苏云金素对玉米象和前２８星瓢虫成虫毒力较低，对玉米象的ＬＣ＿（５０）为４１０．５２μｇ／ｍｌ；以５０～４５０μｇ／ｍｌ浓度感染２８星瓢虫成虫，死亡率仅４～３２％，其产卵量明显低于对照组，但对卵的孵化率没有影响。

苏云金素对昆虫细胞株的毒力试验

苏云金杆菌伴孢晶体毒素对昆虫细胞株的毒性以及用昆虫细胞株测定伴孢晶体毒素的含量,国内外都发表了一些研究报告,并有所进展。然而,苏云金素对昆虫细胞株的毒性尚未见这方面的报告,本文将简报这一研究结果。

苏云金芽胞杆菌产苏云金素菌株CT-43及其缺失突变株的差异蛋白

【目的】苏云金素(Thuringiensin)的合成和代谢途径的相关研究在国内外一直进展缓慢,本文拟从蛋白质组水平揭示与苏云金素合成或代谢相关的蛋白。【方法】利用双向电泳技术研究了高产苏云金素的苏云金芽胞杆菌野生菌株CT-43、其高产突变菌株CT-43-1C及不产突变菌株BMB0806在蛋白表达水平的差异,然后对差异蛋白点进行质谱鉴定,最后对鉴定出的蛋白进行生物信息学分析。【结果】与野生型和高产菌株相比,在BMB0806中发现了13个差异显著的蛋白点,鉴定出了其中的9个,生物信息学结果显示有6个蛋白可能与苏云金素合成或代谢相关。【结论】通过蛋白质组研究找到了6个可能与苏云金素合成或代谢相关的蛋白,为苏云金素合成基因簇的克隆和合成途径的验证提供了有力的证据。

苏云金素对东亚小花蝽捕食作用的影响

采用二次回归最优设计，研究苏云金素对东亚小花蝽捕食作用的影响，得出日均捕食量（ｙ）与猎物（ｘ１）和捕食者（ｘ２）之间互作关系模型。处理捕食数量回归方程：ｙ＝－０．００２１ｘ２１＋１．２１１２ｘ２２＋０．８８２２ｘ１－１０．３４６５ｘ２－０．０６４９ｘ１ｘ２＋１．７１７４；对照捕食数量回归方程：ｙ＝－０．００１７ｘ２１＋０．７７３４ｘ２２＋０．６９４１ｘ１－６．４９１４ｘ２－０．０４７４ｘ１ｘ２－０．４６３６。综合定性分析和定量分析结果，苏云金素处理东亚小花蝽若虫，减弱了其对二斑叶螨卵的捕食能力，但二者的差异不显著。

苏云金素合成基因簇中非核糖体肽合成酶基因thu2功能的初步分析

对苏云金素生物合成基因簇中编码非核糖体肽合成酶基因thu2进行基因缺失插入失活的研究。用温敏型质粒pHT304-TS构建基因thu2的插入缺失质粒pEMB1434,电转化苏云金芽胞杆菌菌株CT-43后,通过抗性筛选和PCR验证得到thu2基因同源双交换基因敲除突变株CT-43-22。HPLC(高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography)检测发现CT-43-22没有苏云金素特征吸收峰;用pHT304构建得到含有完整thu2基因的回补质粒pEMB1435,电转化CT-43-22后得到互补重组菌CT-43-22b,发现其恢复了苏云金素的产生。显微镜观察突变株和互补重组菌均能产生正常的晶体和芽胞。thu2的基因敲除和基因互补实验证明,thu2基因为CT-43苏云金素生物合成的必需基因,但对晶体和芽胞的形成没有影响。

苏云金素毒理学安全性评价试验研究──亚急性毒性研究

在剂量为３．１２ｍｇ／ｋｇ，连续经口染毒２８天时，苏云金素可致雌性大鼠血红蛋白含量明显降低；对雌、雄大鼠体重增长具明显抑制作用；对雄性大鼠血红蛋白含量及雌雄大不肝、肾功能和脏器系数未见不良影响。

苏云金素防治棉铃虫及对其主要天敌影响的研究

田间测试了苏云金素对棉铃虫及其主要天敌的影响。苏云金素与其他供试Ｂｔ制剂比较，对紫外线相对稳定，能抵抗田间不良环境的影响，药后７天，棉铃虫死亡率为９２．５９％。施药后１５天，存活幼虫中有４２．８６％仍在叶部活动，苏云金素对天故的影响程度相对较小，施药后东亚小花蝽和中华草蛉种群数量增加，而龟纹瓢虫种群数量一直处于较低水平。结果表明，苏云金素对棉铃虫具有明显的控制作用，能够减少蕾铃被害数量，达到保产增收的目的。

苏云金素与苏云金杆菌芽孢晶体混剂对小菜蛾的增效作用

将苏云金素和苏云金杆菌的孢晶制剂分别作为单一制剂,用混和饲料感染法在室内测定苏云金素分别与苏云金杆菌HD—1、CT—43、81—6、WP—2等4个菌株孢晶制剂的混剂对小菜蛾幼虫的协同作用。按Sun—Johnson毒力指数法计算结果表明,苏云金素对所有供试菌的孢晶制剂都有增效作用,共毒系数从127.43至415.62不等。当混剂以芽孢晶体为主要活性组分时,苏云金素占全部活性组分的16.7％(w/w)情况下增效作用最强,共毒系数值235.31;当以苏云金素为混剂的主要活性组分时,苏云金素与芽孢晶体之比为100:10(w/w)情况下增效作用最强,共毒系数值可达1021.49。增效作用的大小因试虫感染毒物时间的长短而异。对于同是3龄的小菜蛾幼虫,苏云金素对3龄末期幼虫的增效作用最显著。

苏云金芽胞杆菌CT-43内生质粒pBMB0558上virD4基因的功能

苏云金芽胞杆菌CT-43高产苏云金素,其内生质粒pBMB0558上virD4基因编码的VirD4蛋白与Ⅳ型分泌系统中结合底物的偶合蛋白(T4CPs)高度同源。本研究利用插入缺失突变方法,构建同源双交换载体,敲除CT-43中的virD4基因,得到1株突变株BMB1122。HPLC检测结果显示,突变株BMB1122发酵上清液中未检测到苏云金素特征吸收峰;进一步通过LCMS-IT-TOF飞行质谱检测突变株胞内代谢物,结果显示其含有与苏云金素合成途径中的所有前体物分子质量相符的质荷比(m/z),这与出发菌株CT-43的结果一致。初步推测,virD4基因与苏云金素的分泌相关,virD4基因的敲除影响苏云金素的分泌。

芽孢杆菌剂与苏脲1号对家蝇幼虫的协同作用和持效

实验室研究结果表明,苏云金杆菌CT—43和YBT—127菌株的孢晶素粉对家蝇幼虫的效果分别为65％和40％,明显高于森田芽孢杆菌的效果(5％),在多种混合应用的组合中,只有CT—43菌株的孢晶粉与苏脲Ⅰ号混合应用有明显的协同作用。苏云金素混入家蝇饲料中在培养室保存15天,对蝇幼虫的毒力没有下降,其他菌剂和苏脲Ⅰ号的毒效均明显下降。改进苏云金杆菌的孢晶素制剂,用于防治家蛹幼虫是有效可行的。