苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3株的cry基因分析及杀虫特性

筛选的苏云金芽孢杆菌野生菌株 1 5A3经鉴定属血清H 2 1型科默尔亚种。用PCR及RFLP方法对其cry1类基因分析证明其含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Ca,cry1D ,cry1I及cry2六种cry基因 ,其cry1A基因N末端 1 45kb片段与已发表的序列有差异。表达晶体蛋白质的分子量分别为 1 3 0 ,79,70 ,6 5 ,5 1和 45kD。对家蝇致畸实验证明其不含 β 外毒素。发酵液对棉铃虫 ,甜菜夜蛾 ,小菜蛾及美国白蛾均具较高的毒力。

苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种和中华甲虫蒲螨对冷杉梢斑螟的杀虫作用

为阐明苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Aizawai Bonnefoi et de Barjac)和中华甲虫蒲螨(Pyemotes zhonghuajia Yu,Zhang and He)分别对冷杉梢斑螟(Dioryctria abietella)老熟幼虫的杀虫效果及对酶活性的影响,以冷杉梢斑螟老熟幼虫为研究对象,分别采用不同菌浓度苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种浸泡的饲料饲喂冷杉梢斑螟老熟幼虫,和接入不同数量中华甲虫蒲螨到冷杉梢斑螟老熟幼虫上,测定两者分别对梢斑螟死亡率以及相应酶活性影响。结果表明:苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种作用于冷杉梢斑螟致死率高达100%,致死中浓度为6584.065菌落/mL。冷杉梢斑螟老熟幼虫在取食不同菌浓度苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种后,对解毒酶乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶均有激活作用;对羧酸酯酶有抑制作用;过氧化氢酶和过氧化物酶随苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种菌浓度的升高以及作用时间的延长,表现出逐渐抑制的作用。中华甲虫蒲螨寄生冷杉梢斑螟,致死率高达90%,半数致死数量为27.454头。中华甲虫蒲螨处理对乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶均有激活作用;虫螨数量比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50时,冷杉梢斑螟幼虫过氧化氢酶表现出抑制-激活-抑制的作用,虫螨数量比为1∶60时,表现为全部抑制作用;对羧酸酯酶和过氧化物酶多表现出抑制作用,虫螨数量比为1∶20、1∶30时,表现出抑制-激活的作用,虫螨数量比为1∶40、1∶50、1∶60时,表现出抑制的作用。苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种和中华甲虫蒲螨主要通过释放毒素来扰乱冷杉梢斑螟老熟幼虫保护解毒酶系动态平衡,干扰幼虫的正常生理代谢,从而起到毒杀冷杉梢斑螟老熟幼虫的作用。

土壤来源的五个苏云金芽孢杆菌新亚种的鉴定

从中国土壤中分离的大量苏云金芽孢杆菌菌株中鉴定出Ｈ４２、Ｈ４３、Ｈ５６、Ｈ６０及Ｈ６２等５种新Ｈ血清型，并进行了形态、培养特征、生化反应、晶体蛋白质成分及毒力特性等项检测鉴定，鉴定了５个苏云金芽孢杆菌新亚种：Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｊｉｎｇｈｏｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｈ４２），Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｇｕｉｙａｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｈ４３），Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｒｏｎｇｓｅｎｉ（Ｈ５６），Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｐｉｎｇｌｕｏｎｓｉｓ（Ｈ６０）及Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｚｈａｏｄｏｎｇｅｎｓｉｓ（Ｈ６２）。毒力生物测定证明５个新亚种的代表菌株对棉铃虫（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍｉｇｅｒａ）、小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌａｘｙｌｏｓｔｅｌａ）、柳蓝叶甲（Ｐｌａｇｉｏｄｅｒａｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒａ）幼虫均无毒力。Ｈ４２、Ｈ４３、Ｈ５６、Ｈ６０对埃及伊蚊（Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ）、斑须按蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）及尖音库蚊（Ｃｕｌｅｘｐｉｐｉｅｎｓ）亦均无毒；Ｈ６２对埃及伊蚊无毒，但对尖音库蚊与斑须按蚊有低毒。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种对花翅摇蚊作用特性研究

为探索对深圳水源红虫污染进行微生物防治的可行性 ,首次用Bacillusthuringiensissubsp .israelensis,简称Bti (苏云金芽孢杆菌以色列亚种 )对花翅摇蚊 (Chironomuskiiensistokunaga)的作用特性进行研究。生物测定表明 ,BtiIPS82和 1 87对花翅摇蚊 3龄幼虫的LC50 ( 2 4h)分别为 2 4 2和 32 6mg L。对标准菌株IPS82进行的发酵研究表明 ,发酵过程中的菌体密度、芽孢形成和溶解氧变化、对花翅摇蚊的毒力之间具有密切联系。IPS82发酵液应用的环境因素中 ,日光照的影响最大 ,可使其毒力半衰期从 2 1d缩短至 1 0d ;环境温度在 1 5℃～ 30℃内变化 ,Bti使蚊幼虫的致死率都保持在 5 0 %左右。当环境温度 35℃时 ,Bti使蚊幼虫的致死率再提高 1 6% ;环境pH偏离 7～ 1 1时 ,IPS82的毒力从 66 7%下降至40 %左右 ,环境pH3时其毒力下降至 1 6% ;在一定的幼虫密度 (低于 30条 1 0 0mL)范围内IPS82发酵液的毒力稳定 ,但幼虫密度高于 30条 1 0 0mL时毒力呈下降趋势。本研究结果表明 :在一定条件下 ,Bti对花翅摇蚊防治具有良好的应用潜力。

一株对鳞翅目高毒力的苏云金芽孢杆菌亚种的分离与鉴定

从四川温江地区采集土壤,采用醋酸钠-抗生素分离法分离到一株苏云金芽孢杆菌,经形态、生理生化测定,该菌为苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种(Bacillus thuringiensissubsp.morrisoni)。生物测定结果表明,该菌对菜青虫表现出较高的毒力,在饲喂浸含伴孢晶体的叶片72 h后校正死亡率达到96.3%。根据Genbank中的序列设计cry基因型鉴定引物,对此菌种进行cry基因型检测,结果表明,该菌含有对鳞翅目高毒力的cry1Ac、cry1Ab和cry1C基因,还含有对植物寄生线虫高毒力的cry5基因。

苏云金芽孢杆菌猝倒亚种Cry1 Aa13基因的克隆及序列分析

根据GenBank中Cry1A类基因序列设计一对特异性引物,以苏云金芽孢杆菌猝倒亚种质粒DNA为模板,应用PCR扩增技术得到一大小约为3.6kb的DNA片段(Cry1Aa13).通过引物步行法测定该片段长3598bp,其中开放阅读框(ORF)长3540bp,编码1180个氨基酸,分子量为133.49kD,等电点pI=5.0.序列比较表明该基因与Cry1Aa类基因高度同源(达95%以上),该基因已在GenBank中登录,登录号为AF510713,并被Btδ 内毒素基因国际命名委员会正式命名为Cry1Aa13.

球形芽孢杆菌Mtx1杀蚊毒素在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的表达

将来源于球形芽孢杆菌SSII 1的mtx1毒素基因克隆至穿梭载体 pBU4上 ,得到mtx1插入方向相反的重组质粒 pMT9和pMT4。含有 pMT9和 pMT4的大肠杆菌转化子能表达产生Mtx1毒素 ,发酵液对敏感和抗性致倦库蚊幼虫具有中度毒杀作用 ;含有pMT9和pMT4的苏云金芽孢杆菌转化子B pMT9和B pMT4在营养体生长阶段对敏感蚊幼和抗性幼虫也具有毒性 ,毒力与野生型SSII 1相当 ,而不同转化子在芽孢形成期的毒力因插入的mtx1基因转录方向不同而表现出差异 ,其中B pMT4对目标蚊幼毒力极低 (LC50 >1 0 0mg/mL) ,而B pMT9对蚊幼虫具有毒性 (LC50 =2 4 9mg/mL)。

苏云金芽孢杆菌不同亚种菌株制剂毒力效价的研究

采用苏云金芽孢杆菌制剂美国标准品:Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1-S-1980(H_(3a3b))对不同亚种制剂:Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus U菌株(H_(4a4b))和Bacillus thuringiensis subsp. galleriae C88菌株(H_5a5b))进行了毒力效价的研究。以U菌株制备的标样与美国标准品对不同试虫进行了比较。生物测定的结果表明,U菌株标样的效价分别为18666.6IU/mg(试虫为马尾松毛虫Dendrolimus punctatus 2龄幼虫)、22956.5IU/mg(试虫为小菜蛾Plutella xylostella 2龄幼虫),均高于美国标样16000IU/mg的水平。其敏感度为小菜蛾大于马尾松毛虫。以U菌株和C88菌株生产的中试产品用美国标准品进行毒力测定,试虫为马尾松毛虫,其结果表明,U菌株产品毒力效价为36444.4IU/mg;C88菌株产品为28521.7IU/mg,两者均明显高于美国标准品。试验结果还表明,采用美国标准品及马尾松毛虫和小菜蛾为试虫,来校正我国目前现有产品的毒效是可行的,用作者编定的BASIC计算程序,以微机进行统计分析,比用计算器进行结果运算准确、迅速。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种cyt1 Aa基因在球形芽孢杆菌中表达

将编码cyt1Aa基因和 p2 0蛋白基因的DNA片段分别克隆连接于两个不同的穿梭载体 pBU 4和pMK 3上 ,构建了重组质粒 pBA 30和 pMA 6,通过电击法 ,将重组质粒分别转化 B .s野生株2 2 97,获得了转化菌株Bs 97 30和Bs 97 6。SDS PAGE和Westernblot分析证实了cyt1Aa基因在转化菌株Bs 97 30中获得了表达 ,而在转化菌株Bs 97 6中未检测到cyt1Aa基因表达的蛋白。转化菌株Bs 97 30中 ,cyt1Aa基因与B .s二元毒素基因同步于菌体生长的对数期起始表达 ,并持续至芽孢形成。生测结果表明 ,转化菌株Bs 97 30中cyt1Aa基因的表达并未明显增强其对敏感和抗性致倦库蚊幼虫的毒力。其原因可能是弱毒性的 cyt1Aa蛋白在转化菌株中的表达量不高。

苏云金芽孢杆菌达姆斯塔特亚种新菌株Btd61的鉴定及其晶体蛋白基因型的初步分析

用选择性培养基从舞毒蛾（Ｌｙｍａｎｔｒｉａｄｉｓｐａｒ）死虫体中分离到苏云金芽孢杆菌新菌株Ｂ－６１，经分类鉴定属苏云金芽孢杆菌达姆斯塔特亚种（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｄａｒｍｓｔａｄｉｅｎｓｉｓ），简称Ｂｔｄ６１．该菌株有８种质粒，４种晶体蛋白，合成二锥体小晶体和不规则大晶体２种伴孢晶体颗粒，对大蜡螟（Ｇａｌｅｒｉａｍｅｌｏｎｅｌａ）和舞毒蛾皆具强毒性．Ｂｔｄ６１携带Ｂ１型的溶原性噬菌体，但又对Ｂ１型的Ｔｂ１０噬菌体有抗性．

苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)发酵液的浓缩工艺研究

通过对苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp. israelensis,Bti)发酵液浓缩工艺的研究,探索了不同温度对浓缩液有效成分的影响程度,比较了不同浓缩方式、不同干燥方式处理下有效成分的回收率。结果表明,采用真空薄膜浓缩方式最终得到的产物质量是离心浓缩方式得到产物质量的176%,效价回收率提高了36%。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白定量检测方法分析

为完善苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringrensis subsp. israelensis)毒素蛋白定量检测方法,试验用一定浓度的磷酸缓冲溶液、纯化水洗涤苏云金芽孢杆菌以色列亚种试样,去除培养基残留。用SDS-PAGE电泳法检测离心后收集到的试样菌体毒素蛋白含量。结果表明,通过磷酸缓冲液及水洗涤试样,解决了试样中杂质干扰毒素蛋白含量检测的关键性问题,采用该方法能够准确对苏云金芽孢杆菌以色列亚种两种主要相对分子质量的毒素蛋白进行检测与定量,且重复性好,检测误差可以控制在5%以内,并且检测结果与产品生物效价存在显著相关性。

苏云金杆菌以色列亚种几丁质酶基因的克隆及序列分析

从苏云金芽孢杆菌以色列亚种 (Bacillusthuringiensissubspisraelensis)中提取基因组DNA ,通过合成 1对特异性引物 ,用touchdownPCR的方法扩增几丁质酶ichi基因序列 (GenBank登录号 :AF5 2 6 379)。ichi序列全长为 2 5 70bp ,含有 1个 2 0 6 7bp的开放阅读框 (ORF) ,编码 6 88个氨基酸 ,推测分子量为 75 79kDa ,等电点pI=5 90的几丁质酶前体。序列和结构比较分析表明 :Ichi氨基酸序列与蜡状芽孢杆菌 (Bacilluscereus) 2 8 9几丁质酶CW、蜡状芽孢杆菌CH几丁质酶B及苏云金芽孢杆菌墨西哥亚种几丁质酶的同源性分别为 97 2 4 %、97 18%、97 6 3% ,而与苏云金芽孢杆菌巴基斯坦亚种的同源性只有 6 3 0 7%。Ichi编码区由分泌信号肽 (46AA)、催化区 (10 5AA)、粘蛋白Ⅲ型同源区 (74AA)及几丁质结合区 (40AA)组成。

cry4Aa、cry4Ba和cry11Aa基因在苏云金杆菌无晶体型菌株中的表达

利用穿梭载体pBU4,将苏云金杆菌以色列亚种 (Bti)的cry4Aa、cry4Ba和cry1 1Aa基因分别转入Bti无晶体突变株 4Q7中 ,获得了转化菌株Bt B60 1、Bt B61 1和Bt B640。SDS PAGE结果显示 :Cry4Aa、Cry4Ba和Cry1 1Aa蛋白均分别获得了表达。透射电镜下观察 ,转化菌株能产生球形或菱形伴胞晶体。转化菌株对敏感和抗性致倦库蚊及白纹伊蚊幼虫的生物测定结果显示 :Cry4Aa、Cry4Ba和Cry1 1Aa蛋白对库蚊和伊蚊的毒力较低 。

含二元毒素基因的苏云金杆菌重组子晶体蛋白分析及其对蚊幼虫的毒性

通过电转化方法将含球形芽孢杆菌（Bacillussphaericus简称B.s)二元毒素基因的重组质粒pCW2转化野生型苏云金杆菌以色列亚种（B．thuringiensissubsp.israelensis简称B．t．i），获得一株含二元毒素基因的重组菌株B＋CW-1。重组菌株能表达二元毒素及δ-内毒素和CytA毒素，并形成2类位于芽孢孢外膜外的伴孢晶体。B＋CW-1对伊蚊（Aedes）、按蚊（Anopheles）和抗性库蚊（Culex）的毒力明显高于B．s，同时也略高产B.t.i菌株，但其杀蚊谱和杀活性水平同B．t．i相似。未发现二元毒素同B．t．i毒素间的协同作用。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒性蛋白基因的克隆及其原核表达

目的从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bti)以色列亚种中获得cry4B、cry11A和cyt1A3种主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行克隆和原核表达。方法根据GenBank上3种基因的已知序列设计合成引物,应用PCR技术扩增目的基因,克隆入pUC19质粒,阳性克隆质粒经酶切和测序鉴定。将测序鉴定的3种蛋白基因克隆入原核表达载体(pET32c)进行原核表达。结果PCR扩增获得特异性的基因片段,重组质粒经酶切后获得预计大小的基因片段,并测序鉴定。序列结果与已知序列一致。原核表达载体经ITPG诱导,获得预计大小的目的蛋白。结论成功克隆了苏云金芽孢杆菌以色列亚种的3个主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行原核表达。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种水剂对新疆额尔齐斯河下游地区蚋的控制研究

目的调查苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bti)水剂对新疆额尔齐斯河下游河岸谷盆地区蚋的控制效果。方法 2012-2015年在新疆生产建设兵团第十师185团,通过室内和野外试验测试Bti对蚋的杀灭能力;采用SPSS 19.0软件的Probit回归方法计算半数致死浓度(LC_(50))、90%致死浓度(LC_(90))及其95%CI。结果在实验室条件下,Bti对蚋幼虫的LC_(50)和LC_(90)分别为0.034×10^(-6)和0.118×10^(-6)g/ml;野外大面积施用Bti,12 h对蚋幼虫的杀灭率>83.21%,24 h杀灭率>97.07%;2013-2015年该地区连续施用Bti,蚋成虫数量降低了89.43%。结论 Bti水剂对蚋幼虫有良好的杀灭和防控效果,对新疆额尔齐斯河下游地区蚋成虫的防控效果显著,为野外蚋的生物防治提供了参考依据。

不同温度下苏云金杆菌对白纹伊蚊的杀虫效果研究

目的探讨在不同环境温度下苏云金杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensisisraelensis,Bti)对白纹伊蚊幼虫的杀伤效果。方法采用Probit analysis生物测定法,检测和比较分析不同环境温度下Bti对白纹伊蚊三龄幼虫的杀伤效果。利用不同浓度Bti处理后的幼虫累积死亡率对应P值和浓度对数值进行线性回归分析,获得线性回归公式,计算LC50和LC95等重要剂量参数。结果Bti对白纹伊蚊幼虫具有明显的杀伤效应,药物起效快。在常规28℃,Bti处理后12 h即出现明显的幼虫死亡,随Bti处理时间的延长和浓度的增大,白纹伊蚊幼虫累积死亡率升高。本研究获得了不同温度下各时间点Bti对白纹伊蚊幼虫毒杀作用的线性回归公式。同一Bti浓度下28℃~32℃的杀虫效果较为理想,20℃的低温度环境下Bti杀虫效果相对最弱;28℃下各时间点的LC95均最低,在24 h、48 h、72 h和96 h的LC95分别为122.418、109.404、96.474和92.229 IU/L。结论Bti对白纹伊蚊三龄幼虫具有很好的杀伤效果,环境温度可影响Bti对白纹伊蚊的杀虫效果,在一定范围内适当升高温度可以增强其杀灭效果;在Bti的实际使用中,应充分考虑温度因素的影响,以达到更好的杀虫效果。

B.t.c. cry1C全长基因的克隆及其在增产菌中的表达

设计的一对引物 ,对苏云金芽孢杆菌科默尔亚种 (Bacillusthuringiensissubsp .colmeri)1 5A3菌株中的cry1C基因进行PCR扩增 ,得到包括结构基因 ,调节基因在内的全长为4 0kb的PCR产物。经两步克隆 ,将此基因连接至穿梭表达载体pHT31 5上 ,得到重组质粒pHT 1C。通过电转化将其导入一株增产菌蜡状芽孢杆菌 (Bacilluscereus) 95 0 9菌株 ,SDS PAGE检测到 1条 60kD左右的蛋白带 ,镜检观察到菱形晶体 ,生测结果表明 ,cry1C基因的导入使Bc95 0 9菌株获得了对甜菜夜蛾的杀虫活性。

我国主要生物农药品种名单

一、微生物农药1.细菌苏云金杆菌、苏云金杆菌以色列亚种、甲基营养型芽孢杆菌9912、甲基营养型芽孢杆菌LW-6、海洋芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌、多粘类芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌KN-03、侧孢短芽孢杆菌A60、短稳杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌B7900、解淀粉芽孢杆菌B1619、解淀粉芽孢杆菌PQ21、解淀粉芽孢杆菌LX-11、沼泽红假单胞菌PSB-S、嗜硫小红卵菌HNI-1。