苏云金芽胞杆菌G033A对三种赤眼蜂寄生番茄潜叶蛾能力的影响

为探究苏云金芽胞杆菌G033A(Bt G033A)对番茄潜叶蛾不同龄期幼虫的毒力大小及对赤眼蜂寄生番茄潜叶蛾能力的影响,本研究采用浸叶法和饲料混毒法分别对番茄潜叶蛾及三种赤眼蜂进行处理,测定了Bt G033A对番茄潜叶蛾不同龄期幼虫和三种赤眼蜂成虫的室内毒力,同时分析Bt G033A对三种赤眼蜂寄生量及功能反应的影响。结果表明,BtG033A对番茄潜叶蛾1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫的LC50分别为25.381、19.537、17.406和15.772 g/L,而对三种赤眼蜂均为低毒。在Bt G033A田间推荐浓度处理后,虽然玉米螟赤眼蜂、螟黄赤眼蜂、松毛虫赤眼蜂对番茄潜叶蛾卵的寄生功能反应模型仍符合HollingⅡ型,但三种赤眼蜂的寄生能力均有所降低。其中,玉米螟赤眼蜂在药剂对照组的寄生量(25粒/皿:18.600粒)、处理猎物时间(0.012d)、控害效能(84.833)、日寄生上限(83.333粒)和搜寻效应均表明其对番茄潜叶蛾的寄生能力强于螟黄赤眼蜂和松毛虫赤眼蜂。此外,在药剂处理后,玉米螟赤眼蜂各项寄生参数同样优于其他两种赤眼蜂。因此,玉米螟赤眼蜂可作为番茄潜叶蛾的优选寄生性天敌之一,并可联合Bt G033A对番茄潜叶蛾进行协同防控。

苏云金芽胞杆菌防治草地贪夜蛾的研究和应用进展

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是世界性的重大农业害虫,至今已在全世界126个国家和地区传播,对玉米等多种主要粮食和经济作物造成严重为害。草地贪夜蛾于2019年1月入侵我国,并迅速扩散至26个省(市/自治区)。2022年草地贪夜蛾发生面积超过3500万公顷。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种用于防治农业害虫的革兰氏阳性细菌,具有对害虫高效专一、环境友好、人畜安全等特点。Bt主要依靠其产生的杀虫蛋白发挥杀虫作用。如今,国际上主要依靠转Bt杀虫基因的抗虫作物以及Bt微生物农药对草地贪夜蛾进行绿色防治。我国目前已开发出Bt天然菌株、基因工程菌株和转基因抗虫作物等多种高效Bt产品用于草地贪夜蛾绿色防治。本文将对国内外Bt防治草地贪夜蛾的最新研究进展进行介绍。

苏云金芽胞杆菌4BM1菌株对油菜菌核病的防治潜力

【目的】前期研究显示苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4BM1菌株可诱导油菜产生对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的系统抗病性。探究其诱导系统抗性机制并分析其生防潜力,为油菜菌核病的生物防治提供菌株资源。【方法】采用实时荧光定量PCR和转录组测序技术分析根部施用4BM1菌株后,油菜叶片中防御相关基因的转录水平;结合4BM1菌株全基因组序列和antiSMASH 2.0软件预测其抗病相关次级代谢产物生物合成的基因簇;采用发酵液灌根的方式将4BM1菌株接种至油菜盆栽幼苗,分析其定殖能力和促生效果。【结果】4BM1菌株可激发油菜叶片产生过敏反应;油菜根部施用4BM1菌株,叶片中参与水杨酸、茉莉酸、乙烯信号和油菜素内酯生物合成途径等基因转录水平显著上调;4BM1菌株的染色体上预测到胞外多糖和其他13个抗病相关次级代谢产物合成的基因簇;4BM1菌株在油菜根际定殖的同时可促进油菜苗期植株的生长。【结论】4BM1菌株可作为防控油菜菌核病、促进油菜幼苗生长有潜力的生物防治资源。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的分离纯化及酶学性质

以苏云金芽胞杆菌为材料 ,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE - 32离子交换柱层析初步纯化 ,获得比活力为15 0 .5Umg-1的酶制剂 .研究酶催化胶体几丁质水解的反应时间和酶量对酶活力的关系 ,探讨酶催化胶体几丁质的最适条件 .温度和 pH对酶活力的影响和酶的热稳定性及酸碱稳定性的结果表明 :酶催化胶体几丁质水解的的最适pH为 5 .6、最适温度为 5 8℃ .该酶在pH 4 .5～ 6 .5区域稳定 ,而在pH >8能很快失活 ;在 5 5℃以下处理 30min ,酶活力保持不变 ;高于 5 5℃ ,酶快速失活 .图 5参

杀线虫苏云金芽胞杆菌NBIN-863高含量悬浮剂的研制

目前我国微生物农药原药生产技术已达到甚至超过发达国家水平,但制剂技术却存在较大差距,主要体现在剂型结构不合理、制剂质量差、农药助剂种类及品种少、剂型加工工艺总体水平还比较落后等方面。苏云金芽胞杆菌(Bt)等功能微生物产品的市场容量及应用效果与剂型是密切相关的。为了明确新型生物杀线剂NBIN-863的最佳施用剂型,特开展此试验。通过对防腐剂、分散剂、悬浮剂等不同助剂的选择,研制了一种高含量Bt悬浮剂(5.2×10~9~7.9×10^(9)CFU/mL)。配方优化试验表明,在Bt发酵液中加入0.4%防腐剂山梨酸钾、1.0%分散剂硅酸镁铝、4.0%悬浮剂木质素磺酸钙,用盐酸调节p H至4.5,54℃热储前芽胞数最高为7.9×10~9 CFU/mL,对秀丽隐杆线虫活性最高,LC_(50)为2.83 mg/L,对黄瓜根结线虫田间防效达68.64%。综合各指标,尤其是对秀丽隐杆线虫的半致死浓度,杀线虫NBIN-863悬浮剂(7.9×10~9CFU/mL)效果最好,不仅流动性好,而且耐贮藏,是防治作物根结线虫病的理想药剂。

凝结芽胞杆菌发酵优化工艺

为提高凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)的生长效率,在摇瓶、发酵罐水平考察了最适的碳源、温度、维生素添加量、pH以及发酵过程存在的氧化胁迫对凝结芽胞杆菌生长代谢的影响,获得了发酵培养基配方,并确定了30 L发酵罐最适培养条件:培养温度为40℃,初始pH为6.2~6.5,培养过程中9~14 h用氨水溶液控pH=5.5,pH大于5.5后停止控制,全程以4.1 mg/(L·h)速率流加半胱氨酸。优化条件下,发酵13 h细胞生物量达1.9×10^(10)CFU/mL,较对照提高363.4%,细胞生长效率为1.5×10^(9) CFU/(mL·h),较对照提高305.4%。显著提高了生物量、缩短了发酵周期,为凝结芽胞杆菌工业化生产提供了重要参考。

生防解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)最新研究进展

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是与枯草芽胞杆菌相似,可产芽胞、革兰阳性(G+)、具有生防活性的益生细菌。其代谢过程中产生的抗菌物质种类多、抗菌谱广,其抗菌制剂或抗菌提取物具有无毒、无害、无残留、抑菌时效长等优点,可广泛应用于果蔬保鲜、果蔬生长期及采后微生物病害的生物防治,是极具开发价值的生防菌。本文从抗菌机理、抗性基因组成、基因工程菌构建、抗性产品开发及对微生物病害防治等几个方面,对解淀粉芽胞杆菌的研究及应用现状进行了归纳和总结,为其在农业生物工程中的规模化安全应用提供参考。

苏云金芽胞杆菌抗菌脂肽初步鉴定及抑菌活性测定

植物枯萎病是影响作物生长的重要因素,利用植物内生菌拮抗病原菌生长,从而降低其危害程度是目前研究的热点。本研究从健康的番茄植株中筛选分离得到一株对番茄枯萎病病原菌有较强拮抗作用的内生细菌B-R1,通过形态学、生理生化以及分子生物学检测分析,鉴定该菌株为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)。为进一步探索该菌株的生防作用,首先将菌株发酵后离心,得到发酵上清液,采用盐酸沉淀法对其活性物质进行粗提,并检测其对大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑菌活性。通过薄层色谱法(TLC)、傅里叶红外光谱(FI-TR)、高分辨液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)分析并鉴定活性物质的结构。结果表明,苏云金芽胞杆菌对尖胞镰刀菌有良好的抑制作用,结构分析初步鉴定抗菌物质中含有丰原素(fengycin),属于脂肽类抗生素。

苏云金芽胞杆菌G033A对新发南美番茄潜叶蛾的室内毒力及田间防效

南美番茄潜叶蛾Tuta absoluta(Meyrick)是新近传入我国的一种世界毁灭性番茄害虫,对我国番茄产业的潜在威胁巨大。为有效控制南美番茄潜叶蛾,测定了新型苏云金芽胞杆菌基因工程菌G033A(Bt G033A)对该昆虫的室内毒力及田间防效。结果表明,在室内条件下,以32000 IU/mg Bt G033A WP处理过的番茄叶片饲喂南美番茄潜叶蛾幼虫,其室内毒力效果由高至底依次为4龄幼虫,3龄幼虫,1~2龄幼虫,致死中浓度LC50分别为14.63、15.59和23.17 g/L;浓度在10 g/L及以上时,Bt G033A对南美番茄潜叶蛾各龄幼虫的毒力均较高,处理后96 h(第4 d)校正死亡率均超过90%。在田间条件下,以Bt G033A WP 100倍液(10 g/L)喷雾防治低龄幼虫即有较好的防效,药后第5 d对1龄和2龄幼虫的校正死亡率分别为89.1%和98.0%,药后第7 d对1龄和2龄幼虫的校正死亡率均为100%;并且,与常用的生物杀虫药剂鱼藤酮的防效相当。研究结果对有机蔬菜生产基地新发南美番茄潜叶蛾的有效控制及其综合防控方案制定,具有重要指导意义。

苏云金芽胞杆菌肠毒素基因的PCR检测

采用多重引物PCR进行了 45株苏云金芽胞杆菌、2株蜡状芽胞杆菌和 2株球形芽胞杆菌溶血素BL ,肠毒素T和entS基因的检测 ,结果表明 95 6%苏云金芽胞杆菌含溶血素hblA基因 ,91 1 %含bceT基因 ,93 3%含entS基因。用两种商业化肠毒素检测试剂盒TECRA和RPLA进行所有菌株肠毒素的体外免疫测定 ,大部分苏云金芽胞杆菌和阳性蜡状芽胞杆菌都能产生不同水平的肠毒素活性 ,同hblA基因PCR检测结果基本相符。尽管DBT0 0 7和T2 4 0 0 1含有hblA基因 ,但用TECRA却检测不到肠毒素 ;Dmu39菌株不含肠毒素基因 ,但用TECRA却检测出高的肠毒素活性。苏云金芽胞杆菌BDT2 4 8和球性芽孢杆菌不含肠毒素基因和肠毒素。

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp .Leesis)菌株YBT 833、鲇泽亚种 (subsp .Aizawai)菌株YBT 1416和库斯塔克亚种 (subsp .Kurstaki)菌株YBT 15 35为出发菌株 ,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针 ,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示 3株菌株的营养期杀虫蛋白基因 ,均位于经XbaI完全消化的 4～ 5kb大小的DNA片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体 ,建立了 3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到 3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15 ,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在 5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌 大肠杆菌穿梭载体pHT315 ,分别得到重组质粒pBMB890 1和pBMB890 2。将它们电转化到vip- 的B .t.受体菌BMB171和 4Q7,获得了相应的工程菌BMB890 1 171,BMB890 2 171,BMB890 1 4Q7和BMB890 2 4Q7。SDS PAGE电泳检测均有 88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了 ,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性 ;其中对小菜蛾的毒力最高 ,LC50 值分别为 2 8.6 ,31.6 ,45 .4和 37.6 μL mL。该结?

苏云金芽胞杆菌原毒素在蒙脱石上的吸附特性研究

采用河南信阳产钠型蒙脱石为实验材料,研究了苏云金芽胞杆菌(Bt)工程菌株WG-001原毒素蛋白(130kDa)在粒径为0～0.2μm和0～2μm的蒙脱石上的吸附特性。结果表明,蒙脱石在碳酸盐缓冲体系(pH9)对Bt原毒素蛋白的等温吸附曲线符合Langmuir方程(r2>0.99),当原毒素与蒙脱石的质量比例相同时,蒙脱石的平均粒径越小,单位质量吸附量越高。在磷酸盐体系(pH6～8)pH7时单位质量吸附量最大,在碳酸盐体系(pH9～11)单位质量吸附量随pH的增加而下降。Bt原毒素在蒙脱石上的吸附0.5～1.0h就能达到平衡。随着蒙脱石质量比例的增加,蒙脱石对原毒素的单位质量吸附量减小,但吸附百分率增加。在10℃～50℃范围内,温度对单位质量吸附量影响不大。透射电镜分析表明,吸附原毒素前后蒙脱石的粒径没有明显改变。XRD分析证实,吸附原毒素后蒙脱石层间距没有发生变化。

苏云金芽胞杆菌cry2Ad基因的克隆及其表达产物的活性分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)SBT2是我国新分离出的一株野生菌株。扫描电镜显示该菌株产生双锥体形晶体。琼脂糖凝胶电泳发现其质粒图谱含有5个条带。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示此菌株产生130kD晶体蛋白。利用PCR-RFLP法进行杀虫基因类型鉴定,发现其含有cry1Aa、cry1Da、cry1Hb、cry1Jb、cry1Ka、cry1Ib、基因。Cry2Ad蛋白的活性至今未见研究报道,本研究克隆和测序了该基因。并对其进行了表达。生物活性测定结果表明其表达产物对舞毒蛾(Lymant-ria dispar)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)有低活性;对大猿叶甲(Colaphellus bowringi)无活性。

苏云金芽胞杆菌晶体毒素对体外培养的日本血吸虫童虫的作用

将感染日本血吸虫的钉螺常规逸蚴，经注射器推压机械断尾获得的童虫，加入内含１０％兔血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养液后，置于单克隆培养板内，以苏云金芽胞杆菌（菌株ＹＢＴ－１９５５）制得的伴胞晶体毒素，以不同的浓度加入以上各孔中于３７℃，５％ＣＯ２培养箱内培养。培养１２ｈ后发现童虫活动力减弱，有些已经死亡；２４ｈ后，随着加入伴胞晶体毒素浓度的增加，童虫死亡率也相应增加，呈正相关（ｒ＝０．８９７）。经毒素蛋白含量为４０ｍｇ／Ｌ处理的童虫，２４ｈ后死亡率为１００％，ＬＤ５０为１５．９５μｇ（１ｍＬ）。

苏云金芽胞杆菌内生质粒提取方法的改进

改进了苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)内生质粒提取技术,提取了Bt库斯塔克亚种、以色利亚种和一株对鳞翅目害虫有活性的野生菌株的质粒,利用琼脂糖凝胶电泳分析了质粒图谱,进一步检测了质粒的浓度与纯度。实验结果表明,该方法与传统技术相比,操作简单、耗时短,提取的质粒纯度高、条带清晰,染色体DNA污染较少。为Bt杀虫基因克隆、质粒特性分析等研究创造了有利条件。

类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌株被鉴定为苏云金芽胞杆菌 ,鞭毛血清型H2 ,幕虫亚种 ;产生卵圆形伴胞晶体 ,伴胞晶体蛋白为 1 0 0kD ;测定了该蛋白的N 末端序列 ,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S 层蛋白具 92 %～ 93%相似性 ;根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱 ,分别克隆了该基因 5′和 3′端所在的 2 9kbXbaI片段和 3 1kbClaIDNA片段 ,彼此间具 0 6kb重叠 ,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆。含该基因的大肠杆菌与表达S 层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征。初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S 层蛋白组成。苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体 ,由于S 层是细胞表面的结构成分 。

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC50为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。

苏云金芽胞杆菌G03 spoIVF操纵子敲除对芽胞和晶体形成的影响

spoIVF是一个普遍存在于芽胞杆菌中的操纵子。在枯草芽胞杆菌中,它编码的两个蛋白是芽胞形成所必需的。采用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌G03菌株中的spoIVF操纵子,构建了spoIVF缺失株G03(spoIVF-)。研究表明:该突变株丧失了形成芽胞和晶体的能力。lacZ基因与cry1Aa基因的启动子融合表达分析发现:突变株中的cry1Aa基因的活性严重降低。利用载体pSTK携带spoIVF操纵子在突变株中的表达,使突变株部分恢复了产胞和形成杀虫晶体蛋白的能力。这说明spoIVF操纵子是所必需的,同时该操纵子还影响σE因子控制的cry1Aa基因表达。

苏云金芽胞杆菌AiiA蛋白对魔芋软腐病菌的抗病活性

AiiA蛋白通过破坏病原菌的信号分子来阻断病原菌的群体感应调节系统,达到抗病的目的,是一种新型的抗病蛋白.根据蜡状芽胞杆菌ATCC14579基因组中aiiA序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌中成功扩增出aiiA基因,其ORF为753bp,测序后经blast检测与已发表的序列相似性均在95%以上.将此基因克隆到pET28a表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,超量表达的蛋白在菌体中以包涵体形式存在,纯化的AiiA蛋白经SDS PAGE电泳检测,表达产物分子量为28×103,致病性测定表明该蛋白对魔芋软腐病菌CZY具有较强的抗病活性.

苏云金芽胞杆菌生物活性成分研究进展

自1901年Ishimata从家蚕(Bambyx mori)中分离出第1株苏云金芽胞杆菌淬倒亚种(Bacillus thuringiensis subsp. sotto)以来,对苏云金芽胞杆菌研究已有百年的历史.现在国际上确认的苏云金芽胞杆菌菌株已有69个血清型[6],近40 000株.