甘蔗苏氨酸脱氨酶基因的克隆与表达分析

应用电子克隆技术．以烟草AAG59585序列为探针．获得了甘蔗苏氨酸脱氨酶（threonine deaminase）基因的全长cDNA，命名为Sc功。经RT—PCR扩增和验证，该基因序列与电子克隆结果一致性高达99％。序列分析结果表明：ScTD基因全长2120bp，具有完整的开放阅读框（ORF，164－1681bp），编码505个氨基酸，该基因编码蛋白定位于微体．为可溶性蛋白，不存在信号肽，二级结构原件多为α－螺旋，含有多个保守功能域，主要在氨基酸合成中发挥作用。电子表达分析结果显示，该基因在甘蔗根尖、根颈、花序、叶片、全株、芽和茎中组成型表达，其中在花序和根中的表达量最高。荧光定量PCR结果分析表明：该基因在甘蔗各组织中均有表达，且在根中的表达量最高。此外，该基因的表达受水杨酸胁迫后表达量最高．约为对照组的43．16倍，其次为聚乙二醇和茉莉酸甲酯．分别为6．90倍和4．40倍．推测该基因的表达与甘蔗抗病虫和抗渗透胁迫有关。此结果为甘蔗ScTD基因的克隆和功能验证以及在甘蔗基因工程中的应用奠定基础。

仿生法制备氧化硅载体固定化苏氨酸脱氨酶及其酶学性质

通过共沉淀法制备无机氧化硅载体,然后将其应用到苏氨酸脱氨酶的固定化研究中。用扫描电子显微镜对氧化硅载体进行表征,优化了固定化条件,当n(Si):n(N)为1∶1、偏硅酸浓度为0.03 mol/L、酶添加量为0.16mg/m L时,固定化的效率最高。接着对固定化酶和游离酶的酶学性质进行了考察,结果发现:固定化酶和游离酶的最适pH都是9.0,最适温度都是45℃,而相对于游离酶,固定化酶在pH 9.0~10.0和温度35~50℃范围内稳定性更好。固定化酶的米氏常数为7.48 mmol/L,重复使用15次后,酶活力保持80%以上。说明仿生氧化硅制备的固定化苏氨酸脱氨酶具有酶活回收率高、力学强度高和操作稳定性好等优势。

谷氨酸棒杆菌苏氨酸脱氨酶基因敲除及对L-亮氨酸发酵的影响

L-异亮氨酸是L-亮氨酸发酵的主要副产物,L-异亮氨酸的积累对L-亮氨酸的发酵及提取均产生不利影响。采用基因重组技术敲除L-亮氨酸产生菌-谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TGL8207的苏氨酸脱氨酶基因ilvA,构建了ilvA缺失株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)TGL8207 ilvA。发酵结果显示:ilvA基因缺失对TGL8207 ilvA的生长影响很小。与供试菌比较,TGL8207 ilvA的L-亮氨酸产量和糖酸转化率分别提高了8.4%和1.9%。

生物催化“一锅法”制备2-氨基丁酸

以克隆表达的苏氨酸脱氨酶(L-TD)和亮氨酸脱氢酶(L-LeuDH)为催化剂,用"一锅法"将天然氨基酸转化为非天然氨基酸,最后结晶回收产物,总收率可达84%左右。所得产物经质谱和核磁共振波谱确证了结构,且HPLC检测其光学纯度>99.9%。该工艺使用的原料和酶价格低廉,又避免了中间的提取分离过程。

氨基酸发酵研究的某些进展

日本以谷氨酸为中心的氨基酸发酵生产每年达数十万吨,可谓世上氨基酸生产大国。这是日本微生物工作者将理论研究与生产实际紧密结合,二十多年奋斗的结果。其起点可以说是从筛选野生型谷氨酸产生菌开始的。这类菌一般是革兰氏染色阳性无芽孢杆菌,有强的谷氨酸脱氢酶活性。