苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶的表征及其在血清尿酸测定中的应用

目的考察苛求芽孢杆菌（ATCC 26904）分泌型尿酸酶的特性和将其应用于直接动力学尿酸酶法测定血清尿酸的有效性。方法苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶经DEAE-cellulose层析纯化后，用于以积分法分析尿酸酶反应曲线预测反应体系本底的直接动力学尿酸酶法测定血清尿酸。结果苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶只含1种肽链，分子量为34．7kD（1kD=0．9921ku），其米氏常数为（0．22±0．01）mmol／L（n=11），黄嘌呤抑制常数为（36±3）μmol／L（n=4）。用此尿酸酶，只要被分析反应曲线终点的底物浓度低于起点的30％，应用积分法就能可靠预测本底；直接测定反应前吸收，可使直接动力学尿酸酶法不受常见血清成分、酶活性变化和15μmol／L黄嘌呤等干扰。监测0．025U／ml尿酸酶反应5min的数据，其线性响应范围为1～50μmol／L；所得临床标本血清尿酸含量（Ct）与过氧化物酶偶联间接终点平衡法（Ce）正相关（Ck=-0．008＋1．046Ce，r=0．996，n=206），但Bland—Altman法分析表明两种方法不一致。结论苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶可用于直接动力学尿酸酶法测定尿酸，并可保障其优势。

苛求芽孢杆菌基因组DNA提取方法的比较

目的:比较不同方法提取苛求芽孢杆菌基因组DNA的差异。方法:用经典CTAB提取法、改进CTAB法(溶菌酶处理结合CTAB提取法)、UniQ柱吸附提取法制备苛求芽孢杆菌基因组DNA,比较产物完整性和用于PCR扩增的有效性。结果:三种方法制备基因组DNA纯度接近,但改进CTAB法产率最高,UniQ法产率最低。经典CTAB法和UniQ法提取基因组DNA易降解。三种方法所得基因组DNA用于PCR扩增效率接近。结论:溶菌酶裂解结合CTAB提取更适合制备苛求芽孢杆菌基因组DNA。

用简并引物快速克隆苛求芽孢杆菌尿酸酶的编码序列

目的:从头克隆苛求芽孢杆菌尿酸酶基因的编码序列。方法:据Edman降解所得N端氨基酸序列(AERTMFYGKGDV)用BLASTp搜索N端相似性>70%细菌尿酸酶;多序列联配比对发现靠近N端和C端的2个保守肽段。据N端已知序列和2个保守肽段设计简并引物进行PCR扩增;将所得片段连接到T载体,转化后筛选阳性克隆测序。结果:据密码子偏好性调整简并引物,获得该尿酸酶从第六位氨基酸到终止密码子之间的编码序列;此尿酸酶共含322个氨基酸残基,原核尿酸酶靠近N端的保守序列ATDSMKNFI从该尿酸酶第70位氨基酸残基左右开始,另一保守序列GKVYTEPR从该尿酸酶第290位氨基酸残基开始但变为GAVFTEPR。结论:用简并引物PCR快速克隆获得了苛求芽孢杆菌尿酸酶的编码序列。

诊断用苛求芽孢杆菌尿酸酶的剂型与储存方法

目的:考察重组苛求芽孢杆菌尿酸酶作为诊断试剂的剂型和储存方法。方法:将此重组尿酸酶制成干粉和液体剂型于-18℃和4℃储存,定期测定酶活性;在干粉制剂时加入保护剂于-18℃储存,在液体制剂时加入防腐剂于4℃储存,间隔适当时间监测酶活性。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离此尿酸酶四聚体和二聚体,染色检测蛋白和酶活性。结果:此尿酸酶干粉和液体制剂在4℃储存28 d后对应的剩余酶活性分别为12%和100%,在-18℃冻存28 d后对应的剩余酶活性分别为24%和92%。在干粉制剂时加海藻糖、蔗糖或甘露醇作为保护剂于-18℃储存56 d后,剩余酶活性对应分别为100%、76%和43%。加叠氮钠或苯甲酸的液体制剂,在4℃储存56 d后对应的剩余酶活性分别为99%和82%。在-18℃储存至无活性的冻干粉制剂经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,发现此尿酸酶主要以无活性二聚体存在而活性四聚体很少。结论:此尿酸酶作为诊断试剂,可加入叠氮钠制成液体剂型在4℃储存。

苛求芽孢杆菌尿囊酸酰胺水解酶性质的研究

研究了苛求芽孢杆菌尿囊酸酰胺水解酶的基本性质、稳定性及调节。粗酶作用于尿囊酸的Ｋｍ为７．１ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｖｍａｘ为５０μｍｏｌ／Ｌ·ｍｉｎ－１·ｍｇ－１蛋白质。Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｄ２＋可部分代替Ｍｎ２＋作为金属辅因子，活力分别为对照的１７％，１４％和１１％。Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋分别抑制酶活力（％）：１６、４０和１００。Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｄ２＋存在时，酶活力被抑制（％）：５８、２８和５９。酶贮于－２０℃６个月未失活。研究了酶的热稳定性和ｐＨ稳定性。该酶对乙醇相当敏感。测试了近６０种化合物对酶反应的效应，其中乙二酰脲、羟基脲、草酸、延胡索酸、柠檬酸、苹果酸、草酰乙酸、丙酮酸、乙酰氧肟酸（全为１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、３－磷酸甘油酸、氨基氧乙酸（全为５ｍｍｏｌ／Ｌ）分别抑制酶活力（％）：１０、７０、１０、１０、１０、２０、５０、４０、９５、２３和４４。

产朊假丝酵母尿酸酶与苛求芽孢杆菌尿酸酶特性的比较

目的探讨产朊假丝酵母尿酸酶与苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的特性。方法复苏、培养新购进菌株以制备尿酸酶,利用硫酸铵分级沉淀法、DEAE纤维素52层析和制备PAGE纯化尿酸酶,测定纯化的尿酸酶的活力、表征,并分析其亚基构成。结果两种尿酸酶分子均为同四聚体,产朊假丝酵母尿酸酶的单肽链分子量和天然酶分子量分别为33.0 ku和134.0 ku,其最适pH值接近8.8,在pH7.4时可保留50%以上活性,该酶的米氏常数(Km)为(32.8±3.1)μmol/L(n=10),黄嘌呤的抑制常数为(4.8±0.2)μmol/L(n=3);而苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶则分别为35.7 ku和151.0 ku,最适pH大于9.0,pH7.4时酶活性保留不到30%,其Km为(204±14)μmol/L(n=8),黄嘌呤的抑制常数为(41±7)μmol/L(n=5)。结论该研究对构建杂合药用尿酸酶以治疗高尿酸血症相关疾病具有一定的理论意义。

反应条件对苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶与嘌呤衍生物作用的影响

用底物尿酸的紫外吸收变化跟踪反应,用单或双底物米氏方程和初速度估算苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶最大反应速度,按Arrenius经验公式得到该尿酸酶在pH 9.2和pH 7.4的活化能,但这些活化不能解释其在两个pH下的催化活性差异.该酶同常见嘌呤衍生物氧嗪酸、黄嘌呤和尿酸有亲和力,但对尿酸亲和力最低,且亲和力与嘌呤衍生物解离成阴离子的能力相关.在生理条件下,该酶对尿酸的亲和力相对于最适条件有显著下降.据此推测,优化静电相互作用选择性增强该酶对尿酸的亲和力是提高其成药性的可能措施之一.

海洋高产尿酸氧化酶菌株筛选鉴定及酶学性质研究

尿酸氧化酶广泛用于常规临床分析和临床药物,在医学治疗和诊断中的重要性日益增加。为得到高产尿酸氧化酶的优良菌株,以大连黄海海泥、海水为材料,依次分别采用透明圈法、酶偶联分光光度法进行初筛和复筛,获一株高产尿酸氧化酶菌株Z7,根据菌株Z7的16S rDNA基因序列和形态学、生理生化特征,该菌株被鉴定为苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)。酶学性质研究表明:尿酸氧化酶蛋白的分子量约为33.1 kD;最适作用温度是25℃,酶活高达673.7 U/mg;最适作用pH为8.0,在pH 8-9表现出较强的稳定性;Fe^3+、Ca^2+对尿酸氧化酶具有激活作用。Ag^+、Hg^2+对该酶抑制性较强,使其几乎丧失活性。该菌株产酶活性及稳定性良好,可为尿酸氧化酶的工业化生产奠定理论基础,并具有潜在开发价值。

微生物尿酸氧化酶的筛选、酶学性质及重组表达

尿酸氧化酶(Urate oxidase,Uox)是一种催化尿酸氧化为尿囊素的酶,常用于尿酸的检测以及痛风和高尿酸血症治疗。文中从土壤中筛选出一株Uox高产菌株OUC-1,经16S rRNA部分基因序列分析,与苛求芽孢杆菌Bacillus fastidiosus序列相似度达99%。B.fastidiosus OUC-1的Uox经纯化后,分析表明该酶反应最适pH和温度分别为10.0和40℃;Uox以尿酸为底物反应动力学参数K_m值为(0.15±0.04)mmol/L(n=5)。Mg^(2+)能够提高该酶性活性,而Zn^(2+)和SDS能强烈抑制该酶的酶活。参考GenBank中苛求芽孢杆菌基因组中的uox基因序列,成功扩增出uox基因,通过SWISS-MODEL对Uox空间结构进行预测,推测该酶是同源四聚体,单亚基分子量为35.38 kDa。文中将uox基因克隆并在大肠杆菌中表达,为后续的Uox的性能改造提供条件和技术支持。