共表达分子伴侣蛋白提高III型普鲁兰水解酶在短小芽孢杆菌中的分泌表达及发酵优化

本研究旨在通过共表达分子伴侣蛋白以及优化发酵条件来提高III型普鲁兰水解酶(TK-PUL)在短小芽孢杆菌中的分泌表达水平。通过构建共表达TK-PUL和分子伴侣蛋白的多种重组短小芽孢杆菌,并以胞外酶活为指标对其进行筛选,确定最有利于TK-PUL分泌表达的分子伴侣蛋白及对应的重组短小芽孢杆菌。在此基础上采用单因素实验和响应面法优化重组短小芽孢杆菌的发酵条件。结果表明,共表达分子伴侣蛋白PrsA^(Ba)的重组短小芽孢杆菌的胞外酶活达到98.79 U/mL,提高了0.31倍。该重组短小芽孢杆菌的最佳培养基包括19.65 g/L葡萄糖、21.46 g/L酵母提取物、12.01 g/L MgCl_(2)·6H_(2)O、9.02 g/L脯氨酸、0.01 g/L FeSO4·7H_(2)O、0.01 g/L MnSO4·4H_(2)O、0.001 g/L ZnSO4·7H_(2)O。在发酵温度为35℃、起始发酵pH为7.0的条件下,该重组短小芽孢杆菌于最佳培养基中培养66 h时,其胞外酶活达到192.68 U/mL,提高了1.56倍。本研究通过共表达分子伴侣蛋白和发酵优化实现了TK-PUL在短小芽孢杆菌的高效分泌表达,为TK-PUL的应用提供了基础。

诊断用苛求芽孢杆菌尿酸酶的剂型与储存方法

目的:考察重组苛求芽孢杆菌尿酸酶作为诊断试剂的剂型和储存方法。方法:将此重组尿酸酶制成干粉和液体剂型于-18℃和4℃储存,定期测定酶活性;在干粉制剂时加入保护剂于-18℃储存,在液体制剂时加入防腐剂于4℃储存,间隔适当时间监测酶活性。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离此尿酸酶四聚体和二聚体,染色检测蛋白和酶活性。结果:此尿酸酶干粉和液体制剂在4℃储存28 d后对应的剩余酶活性分别为12%和100%,在-18℃冻存28 d后对应的剩余酶活性分别为24%和92%。在干粉制剂时加海藻糖、蔗糖或甘露醇作为保护剂于-18℃储存56 d后,剩余酶活性对应分别为100%、76%和43%。加叠氮钠或苯甲酸的液体制剂,在4℃储存56 d后对应的剩余酶活性分别为99%和82%。在-18℃储存至无活性的冻干粉制剂经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,发现此尿酸酶主要以无活性二聚体存在而活性四聚体很少。结论:此尿酸酶作为诊断试剂,可加入叠氮钠制成液体剂型在4℃储存。

苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶的表征及其在血清尿酸测定中的应用

目的考察苛求芽孢杆菌（ATCC 26904）分泌型尿酸酶的特性和将其应用于直接动力学尿酸酶法测定血清尿酸的有效性。方法苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶经DEAE-cellulose层析纯化后，用于以积分法分析尿酸酶反应曲线预测反应体系本底的直接动力学尿酸酶法测定血清尿酸。结果苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶只含1种肽链，分子量为34．7kD（1kD=0．9921ku），其米氏常数为（0．22±0．01）mmol／L（n=11），黄嘌呤抑制常数为（36±3）μmol／L（n=4）。用此尿酸酶，只要被分析反应曲线终点的底物浓度低于起点的30％，应用积分法就能可靠预测本底；直接测定反应前吸收，可使直接动力学尿酸酶法不受常见血清成分、酶活性变化和15μmol／L黄嘌呤等干扰。监测0．025U／ml尿酸酶反应5min的数据，其线性响应范围为1～50μmol／L；所得临床标本血清尿酸含量（Ct）与过氧化物酶偶联间接终点平衡法（Ce）正相关（Ck=-0．008＋1．046Ce，r=0．996，n=206），但Bland—Altman法分析表明两种方法不一致。结论苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶可用于直接动力学尿酸酶法测定尿酸，并可保障其优势。

用简并引物快速克隆苛求芽孢杆菌尿酸酶的编码序列

目的:从头克隆苛求芽孢杆菌尿酸酶基因的编码序列。方法:据Edman降解所得N端氨基酸序列(AERTMFYGKGDV)用BLASTp搜索N端相似性>70%细菌尿酸酶;多序列联配比对发现靠近N端和C端的2个保守肽段。据N端已知序列和2个保守肽段设计简并引物进行PCR扩增;将所得片段连接到T载体,转化后筛选阳性克隆测序。结果:据密码子偏好性调整简并引物,获得该尿酸酶从第六位氨基酸到终止密码子之间的编码序列;此尿酸酶共含322个氨基酸残基,原核尿酸酶靠近N端的保守序列ATDSMKNFI从该尿酸酶第70位氨基酸残基左右开始,另一保守序列GKVYTEPR从该尿酸酶第290位氨基酸残基开始但变为GAVFTEPR。结论:用简并引物PCR快速克隆获得了苛求芽孢杆菌尿酸酶的编码序列。

产朊假丝酵母尿酸酶与苛求芽孢杆菌尿酸酶特性的比较

目的探讨产朊假丝酵母尿酸酶与苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的特性。方法复苏、培养新购进菌株以制备尿酸酶,利用硫酸铵分级沉淀法、DEAE纤维素52层析和制备PAGE纯化尿酸酶,测定纯化的尿酸酶的活力、表征,并分析其亚基构成。结果两种尿酸酶分子均为同四聚体,产朊假丝酵母尿酸酶的单肽链分子量和天然酶分子量分别为33.0 ku和134.0 ku,其最适pH值接近8.8,在pH7.4时可保留50%以上活性,该酶的米氏常数(Km)为(32.8±3.1)μmol/L(n=10),黄嘌呤的抑制常数为(4.8±0.2)μmol/L(n=3);而苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶则分别为35.7 ku和151.0 ku,最适pH大于9.0,pH7.4时酶活性保留不到30%,其Km为(204±14)μmol/L(n=8),黄嘌呤的抑制常数为(41±7)μmol/L(n=5)。结论该研究对构建杂合药用尿酸酶以治疗高尿酸血症相关疾病具有一定的理论意义。

芽孢杆菌分泌型表达载体的构建

以地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶信号肽编码区为基础构建了具有Pst Ⅰ、Nhe Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ、Sal Ⅰ多酶切点的芽孢杆菌分泌型载体pAMY403,其分泌效率与质粒pAMY 413相同,而表达水平提高了50%,并能使外源β-内酰胺酶基因正常表达和分泌。质粒pAMY403的多酶切点可以满足外源基因插入产生非融合蛋白质,也可满足以三种不同读码框架插入外源基因产生融合蛋白质,因而能适应构建不同分泌型工程菌株的要求。

3种渗透剂对转基因烟草根系枯草芽孢杆菌纤溶酶(BSFE)分泌的调节

用0.05%～8.00%的甘露醇、山梨醇和聚乙二醇6000等3种渗透调节剂可提高转枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillussubtilisfibrinolyticenzyme,BSFE)转基因烟草(NicotianatabacumL.)根系BSFE的分泌表达水平,其水培液BSFE活性在15d内基本呈抛物线型变化趋势。经3种渗透剂处理后转BSFE基因烟草水培液的BSFE活性峰值明显高于对照,且出现时间比对照相对延迟1-2d。甘露醇、山梨醇和聚乙二醇6000可作为该转基因烟草根系BSFE分泌表达的有效化学调节剂。

多粘类芽孢杆菌纤维素酶基因bglA,bglB和EG在乳酸菌中的分泌表达

通过PCR扩增获得乳酸菌(Lactobacterium lactis MG1363)的usp45基因,将其克隆到乳酸菌(L.lactis)食品级表达载体pNZ8048中获得分泌型表达载体pNZ-X;然后将多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶基因bglA、bglB及内切β-葡聚糖酶基因EG分别连接载体pNZ-X,获得重组质粒pNZ-X::bglA,pNZ-X::bglB和pNZ-X::EG,将3个质粒电转导入L.lactis NZ9000,得到重组乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ-X::bglA、L.lactis NZ9000/pNZ-X::bglB和L.lactis NZ9000/pNZ-X::EG,并测定分泌性表达的BglA,BglB和EG的酶活性。结果显示:3个酶大小均在50kU;DNS法测定酶活力表明重组菌株的酶活力显著低于多粘类芽孢杆菌的酶活力(P<0.05),但具有一定的活性;刚果红染色结果也表明重组乳酸菌分泌产生的酶可产生明显的水解圈。试验为重组纤维素酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案,为秸秆的降解研究奠定了基础。

地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化方法

通过体外处理诱导地衣芽孢杆菌产生感受态性能 ,同时调整参数 ,建立了感受态细胞对质粒 pAPR的高效电转化方法 .当质粒DNA为 1.5 μg/mL、转化时电压为175 0V时 ,可得到 2 6 1个转化子 ,经鉴定均为阳性克隆子 .此为以芽孢杆菌为宿主进行高效电转化及为建立适合工业应用的分泌型表达载体提供参考 .

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku,同核酸序列测定所推导的值相符。

反应条件对苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶与嘌呤衍生物作用的影响

用底物尿酸的紫外吸收变化跟踪反应,用单或双底物米氏方程和初速度估算苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶最大反应速度,按Arrenius经验公式得到该尿酸酶在pH 9.2和pH 7.4的活化能,但这些活化不能解释其在两个pH下的催化活性差异.该酶同常见嘌呤衍生物氧嗪酸、黄嘌呤和尿酸有亲和力,但对尿酸亲和力最低,且亲和力与嘌呤衍生物解离成阴离子的能力相关.在生理条件下,该酶对尿酸的亲和力相对于最适条件有显著下降.据此推测,优化静电相互作用选择性增强该酶对尿酸的亲和力是提高其成药性的可能措施之一.

重组高分泌型枯草芽孢杆菌重组表达系统的开发与应用

长期以来，工业生物技术产业广泛使用大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和链霉菌表达系统等表达系统。枯草芽孢杆菌作为食品级宿主，长期应用于食品发酵、工业酶制剂的生产，是总体评价安全（generally recognized as safe，GRAS）菌种。