苜蓿轮枝菌的生物学特性及抗病种质材料筛选

在室内对苜蓿轮枝菌菌株Ms197和Ms198的最适生长温度、pH值、碳源、氮源、产毒能力及致病力进行测定,同时利用蘸根接种法对37份苜蓿材料的抗病水平进行评价。结果表明,苜蓿轮枝菌菌株Ms197和Ms198在温度5~35℃和pH值4~11范围内均能生长和产孢,具有较强的温度和酸碱度适应性,在温度5~35℃范围内菌落生长速率分别为0.20~4.14 mm/d和0.48~4.12 mm/d,产孢量分别为3.17×10^(5)~4.12×10^(8)和1.02×10^(6)~4.27×10^(8)。在pH值4~11范围内菌落生长速率分别为1.26~3.96 mm/d和1.39~3.97 mm/d,产孢量分别为5.5×10^(5)~4.35×10^(8)和7.67×10^(5)~4.70×10^(8)。最适菌落生长温度和pH值分别为25℃和6~9,最适产孢温度和pH值分别为20℃和9;可利用多种碳源和氮源生长,综合来看,碳、氮源分别为可溶性淀粉和牛肉膏的培养基最适于菌落生长,碳、氮源分别为D-牛乳糖和胰蛋白胨的培养基最适于菌株产孢。菌株Ms197和Ms198的产毒能力和致病力无显著差异。将菌株Ms198接种于37份苜蓿材料,28 d后均表现出不同程度的黄萎病症状,发病率、死亡率和病级分别介于5.33%~100.00%、0.00%~88.20%和1.05~4.88之间;表现高抗、中抗、中感和高感的材料分别为14份、8份、7份和8份,占比分别为37.84%、21.62%、18.92%和21.62%,未发现免疫品种。

苜蓿轮枝菌RPA/CRISPR-Cas12a快速检测方法的建立

苜蓿轮枝菌Verticillium alfalfae是我国重要的进境植物检疫对象,能够对十几种作物造成严重危害。为了快速检测苜蓿轮枝菌,本研究选用苜蓿轮枝菌的特征序列扩增区域[sequence characterized amplified region(SCAR)marker]作为目标基因,设计了特异性引物Va-RPA-F/Va-RPA-R和CRISPR引导RNA(Va-crRNA),建立了重组酶聚合酶等温扩增技术结合CRISPR-Cas12a的快速检测方法。对该检测体系的反应时间、组分浓度等进行优化,结果显示苜蓿轮枝菌基因组DNA在39℃恒温条件下扩增30 min后,其扩增产物用基于CRISPR-Cas12a的荧光法和侧向流层析试纸条两种方法检测,可检测到10.6pg基因组DNA,其灵敏度与实时荧光定量PCR结果相当,加标回收实验结果证明本研究建立的方法可成功用于植物组织中苜蓿轮枝菌的快速检测。

苜蓿轮枝菌的生物学特性分析及ATMT遗传转化体系的建立

为了揭示苜蓿轮枝菌Verticillium alfalfae的生物学特性及其致病机理,在室内条件下测定不同温度、pH值、碳源和氮源对菌株Ms198的生长速率和产孢量的影响,同时利用农杆菌转化法(Agrobactirium tumfacience-mediated transformant,ATMT)将带有潮霉素(Hygromycin,Hyg)抗性标记和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因的双元载体转入苜蓿轮枝菌的分生孢子,获得147株阳性转化子,以野生型菌株为对照,对挑取的15株阳性转化子的菌落形态、生长速率、产孢量、孢子萌发率、粗毒素分泌量和致病力进行研究。结果表明,苜蓿轮枝菌具有较宽的温度和酸碱度适应范围,最适生长和产孢温度分别为25℃和20℃,最适生长pH值为6~9,最适产孢pH值为9。可以利用多种碳、氮源,最适生长的碳、氮源分别为可溶性淀粉和牛肉膏,最适产孢的碳、氮源分别为D-牛乳糖和胰蛋白胨。与野生型菌株相比,15株供试转化子中有66.67%的转化子在菌落形态方面与野生型菌株无明显差别,而其生长速率、产孢量和孢子萌发率均有不同程度的降低。在产毒能力和致病力方面,1株转化子的粗毒素分泌量显著高于野生型菌株,9株显著低于野生型菌株,其余5株与野生型菌株无显著差异;4株转化子的致病力显著低于野生型菌株,其余11株转化子的致病力与野生型菌株均无显著差异。研究结果表明,转化子的生物学特性以及产毒能力和致病力,随外源基因插入位点的随机性而有所变化。

黄萎病菌对3种豆科牧草交互侵染性研究

为预防黄萎病菌在豆科牧草轮作或间作过程中所产生的交互侵染,将5株来自沙打旺寄主的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分别接种到苜蓿和红豆草上,3株来自红豆草寄主的大丽轮枝菌分别接种到苜蓿和沙打旺上,2株来自苜蓿寄主的苜蓿轮枝菌(V.alfalfae)分别接种到沙打旺和红豆草上,并对所有接种植株进行再分离及分离物的形态学和特异性引物PCR分子鉴定,分别评价3种豆科牧草黄萎病菌对苜蓿、沙打旺和红豆草寄主的交互侵染性。结果表明,3种豆科牧草黄萎病菌具有一定的交互侵染性,所有供试菌株都能单独侵染苜蓿、沙打旺和红豆草3种寄主,但对不同寄主的致病力存在较大差异。其中,来源于苜蓿的菌株Ms197和Ms198对3种寄主的致病力均表现为最强,病情指数分别为49.75和50.21、57.44和58.78、61.00和61.00;来源于沙打旺和红豆草的大丽轮枝菌对自身寄主的致病力均表现为最强,对其他两种寄主表现出相对较弱的致病力。再分离物与接种物的形态及分子生物学特征均相符,表明接种植株所表现出的黄萎病症状确由接种物的侵染而造成的。

苜蓿黄萎病的发生、危害及检测

中文苜蓿(Medicago sativa)黄萎病是由苜蓿轮枝菌(Verticillium alfalfae)引起的毁灭性真菌病害,对欧洲、北美洲的苜蓿产业造成了巨大的经济损失,是我国进出口检疫性植物病害。我国先后于1998和2014年在新疆多地和甘肃张掖地区有苜蓿黄萎病发生的报道。本文综述了苜蓿黄萎病的病原菌—苜蓿轮枝菌的分类地位和形态学特征,病害的侵染循环和流行规律,病害造成的损失与检测防治技术,病害在国外和国内的传播、发生情况及为我国苜蓿产业带来的风险,最后对苜蓿黄萎病的研究方向进行了展望。

宁夏马铃薯黄萎病病原菌分离鉴定及寄主范围测定

为明确引起宁夏马铃薯黄萎病病原菌种类,本试验通过常规组织分离法对采自宁夏马铃薯主栽地区固原和西吉的27株马铃薯黄萎病标样进行了分离,共获得11株分离物。采用形态学并结合肌动蛋白(ACT)、延伸因子-1α(EF1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)、色氨酸合成酶(TS)的多基因系统发育分析方法,11株分离物均被鉴定为非苜蓿轮枝菌(Verticillium nonalfalfae)。致病性测定结果表明,该轮枝菌能够侵染马铃薯植株幼苗并引致典型的黄萎病症状。非苜蓿轮枝菌对茄科、菊科、豆科、十字花科、葫芦科和锦葵科等6科13种双子叶作物的致病性测定结果表明,其对西葫芦、黄瓜、茄子、烟草、豇豆、棉花和向日葵的致病性强,对番茄、辣椒、生菜和白菜致病力弱且发病缓慢,对西蓝花和苜蓿无致病性。