α-苦瓜素对巨噬细胞炎性细胞因子风暴的选择性抑制作用

目的α-苦瓜素(α-momorcharin,α-MMC)能受体依赖性靶向作用于单核细胞,调节其细胞因子表达而发挥免疫调节作用,但对巨噬细胞是否具有选择性调节作用尚不清楚。本实验通过细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的M1型炎性巨噬细胞模型,观察α-MMC对其炎性细胞因子风暴的抑制作用,并探讨其可能的靶向作用机制。方法Western blot法检测WIL2-S B淋巴细胞、H9 T淋巴细胞、THP-1单核细胞和M0巨噬细胞LRP1受体蛋白表达;CCK-8法检测4种细胞的生存率;ELISA检测M1巨噬细胞炎性细胞因子的表达水平;Western blot法检测M1巨噬细胞TLR4信号通路相关蛋白的表达。结果巨噬细胞具有与单核细胞一致的高密度LRP1受体;α-MMC在4个细胞上的存活率与该受体的密度呈正相关;α-MMC以剂量和时间依赖性抑制M1巨噬细胞的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α和MCP-1表达;α-MMC对TLR4信号通路的TAK1/p-TAK1、p-JNK、p-AP1和p-p65信号蛋白有明显的抑制作用,这种抑制作用能被LRP1受体阻断剂阻断。结论α-MMC通过LRP1受体介导,抑制TLR4信号通路的TAK1,进而抑制下游NF-κB和MAPK通路,从而选择性抑制巨噬细胞炎性细胞因子表达。α-MMC对巨噬细胞的选择性免疫抑制作用可能使其成为治疗急性感染巨噬细胞激活综合征(macrophage activation syndrome,MAS)的非常有前途的药物。

α-苦瓜素和β-苦瓜素的研究进展

综述α－苦瓜素和β－苦瓜素的提纯、理化性质、生物学性质及作用机理的探讨。

苦瓜素对柯萨奇B_3病毒核糖核酸的作用及其机制

目的 观察苦瓜素对急性柯萨奇B3 病毒 (CVB3 )心肌炎心肌中CVB3 RNA量的影响 ,并对苦瓜素的抗病毒机制及其与干扰素 (INF)的关系进行探讨。方法 以CVB3 感染Balb/C小鼠建立病毒性心肌炎实验模型 ,随机分为苦瓜素处理组和生理盐水对照组 ,同时设立正常小鼠对照组。用定量逆转录聚合酶链反应技术(RT PCR)检测心肌组织中CVB3 RNA量 ,酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测小鼠血浆INF α及INF γ含量。结果 苦瓜素处理组心肌中CVB3 RNA量明显低于生理盐水对照组 ,两者比较有显著差异 (t =5 .14 6 8 P =0 .0 0 0 9) ;生理盐水对照组INF α水平较正常小鼠对照组低 ,两者有显著差异 (P <0 .0 1) ,INF γ较正常稍高 ,但两者无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;苦瓜素处理组两种INF水平均升高 ,与生理盐水对照组比较 ,INF α水平两者显著性差异 (P <0 .0 1) ,但INF γ水平两组无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;心肌组织中CVB3 RNA量与血浆INF α具有明显负相关 (r=- 0 .8390 P =0 .0 0 2 4 ) ,而与INF γ相关性不明显 (r =- 0 .6 0 5 9 P =0 .0 6 34)。结论 苦瓜素抑制CVB3 RNA复制 ,为一种有效的抗CVB3 药物 ,抗病毒作用与诱生干扰素 ,尤其是与INF

苦瓜素对小鼠柯萨奇B_3病毒性心肌炎的治疗作用

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是常见的获得性心肌疾病之一,近年来发病率逐年上升,成为青少年猝死的重要原因,严重危害人类健康,但目前尚无有效的抗病毒药物治疗.苦瓜为葫芦科属植物苦瓜Momordica charantia L.的果实,已有数百年的药食两用史.最近国内外学者从苦瓜果肉、种仁中分离纯化出多种有效成分,发现有明显的抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等多种功效,具有很高的药用价值[1].笔者从苦瓜果肉中分离纯化一种相对分子质量为2.8×104的蛋白质有效成分,称之为苦瓜素(momordicin),在体外有明显的抗亲心性柯萨奇B3病毒(coXsickievirus B3,CVB3)的作用[2],本实验观察苦瓜素治疗实验性小鼠CVB3病毒性心肌炎的疗效.

苦瓜素对柯萨奇B_3病毒RNA复制抑制作用的研究

为观察苦瓜素对柯萨奇B3(CVB3)病毒RNA复制的抑制作用 ,采用差示逆转录聚合酶链反应技术 ,定量观察苦瓜素在体内外对RNA复制的影响。结果显示在体外、体内实验中苦瓜素组CVB3 RNA水平明显低于生理盐水对照组 ,P <0 0 0 1。提示苦瓜素具有明显抑制CVB3 RNA复制的作用 。

苦瓜素对柯萨奇B_3病毒所致病毒性心肌炎小鼠肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的观察苦瓜素对柯萨奇B3病毒(CVB3)所致病毒性心肌炎大鼠心肌组织TNF-α水平、基因转录及相应蛋白质表达的影响,探索苦瓜素治疗病毒性心肌炎的药理机制。方法50只Balb/c实验小鼠随机分为苦瓜素治疗组(20只)、病毒感染空白对照组(20只)、正常对照组(10只)。苦瓜素治疗组与病毒感染空白对照组分别予腹腔注射0.1mL内含1×105TCID50的PRIM1640液,而正常对照组予腹腔注射同等体积培养液。苦瓜素剂量为25mg/(kg.d),1次/d,疗程7d。第15天取小鼠心肌采用ELISA进行TNF-α测定,HE染色行心肌病理检查,RT-PCR检测TNF-αmRNA转录水平,免疫组织化学测定TNF-α蛋白表达。结果与病毒感染空白组比较,苦瓜素治疗组小鼠心肌病理积分明显减少[(3.26±0.84)vs(1.56±0.48),t=3.90P<0.01],大鼠心肌组织TNF-α水平明显降低[(85.6±16.7)vs(34.5±10.3),t=5.24P<0.01],大鼠TNF-αmRNA转录水平亦显著减少[(0.09±0.02)vs(0.41±0.06),t=7.37P<0.01]。结论苦瓜素通过抑制TNF-α基因转录与蛋白质表达、降低心肌TNF-α水平,对Balb/c小鼠CVB3致病毒性心肌炎具有明显的治疗作用。

苦瓜素Ⅰ对亚洲玉米螟的生物活性及对其幼虫体内代谢酶活性的影响

【目的】为研究苦瓜素Ⅰ对亚洲玉米螟Ostrinina furnacalis(Güenée)的生物活性和体内相关酶活性的影响。【方法】采用饲料混药法测定了苦瓜素Ⅰ对亚洲玉米螟生长发育和繁殖的影响,并以生命表的方法评价了苦瓜素Ⅰ对亚洲玉米螟实验种群增长的控制作用;采用酶标仪测定了苦瓜素Ⅰ对亚洲玉米螟幼虫海藻糖酶和磷酸酯酶活性的影响。【结果】用含0.25,0.5,1.0,2.0和4.0 mg/g浓度苦瓜素Ⅰ的人工饲料饲喂亚洲玉米螟3龄幼虫3 d,幼虫的存活率明显降低,LC50为3.2 mg/g;对幼虫体重增长的抑制作用显著,在4.0 mg/g浓度下,第1,2和3天体重增长的抑制率分别为76.87%,78.24%和79.94%,且发育历期明显延长;苦瓜素Ⅰ各浓度处理组中亚洲玉米螟蛹的历期和成虫寿命与对照相比差异不显著,但苦瓜素Ⅰ明显降低了亚洲玉米螟雌成虫的产卵量,4.0 mg/g浓度下,产卵抑制率高达73.55%。苦瓜素Ⅰ对亚洲玉米螟幼虫海藻糖酶、酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶活性均有明显的抑制作用,处理24,48和72 h后,对亚洲玉米螟幼虫海藻糖酶活性的IC50分别为3.8,2.9和4.9 mg/g;对酸性磷酸酯酶活性的IC50分别为3.1,2.6和1.5 mg/g,对碱性磷酸酯酶活性的IC50分别为3.3,1.9和3.6 mg/g。【结论】苦瓜素Ⅰ能显著抑制亚洲玉米螟幼虫的生长发育及成虫的生殖力,使其实验种群的增长受到明显控制。苦瓜素Ⅰ抑制亚洲玉米螟幼虫体内海藻糖酶和磷酸酯酶活性是其作用机制之一。

苦瓜素降血糖作用试验研究

目的研究苦瓜素对血糖的影响,为临床试验提供依据。方法选用正常小鼠、自发性高血糖小鼠、链脲霉素诱发高血糖大鼠,观察苦瓜素对血糖、血清胰岛素及糖化血红蛋白(HbA1C)的影响。结果苦瓜素(20,40,80mg/kg)对正常小鼠血糖无明显影响,但能降低自发性高血糖小鼠血糖及升高血清胰岛素;苦瓜素(14,28,56mg/kg)能降低链脲霉素诱发高血糖大鼠的血糖及HbA1C,能推迟大鼠口服蔗糖后血糖升高时间及降低血糖峰浓度。结论苦瓜素能降低血糖、促进胰岛素分泌及降低HbA1C,推迟口服蔗糖后血糖升高时间及降低血糖峰浓度。

苦瓜凝集素的制备及部分性质研究

苦瓜凝集素的制备及部分性质研究王海仁，孙晓阳，王庆华，徐誉泰，田少敏（山东大学生物系，济南２５０１００）１９７２年，Ｔｏｍｉｔａ~［１］等人首先报道了从苦瓜中分离到具有凝集Ｏ型人红细胞，并为Ｄ－半乳糖抑制的苦瓜凝集素（ＭｏｍｏｒｄｉｃａＣｈａｒａｎｔ?..

苦瓜α-苦瓜素基因克隆与单倍型分析

为了揭示苦瓜α-苦瓜素基因的完整结构及单倍型,本研究以35份苦瓜初级核心种质为材料,克隆α-苦瓜素基因,结果显示,α-苦瓜素基因全长993 bp,包括60 bp的5'-UTR,72 bp的3'-UTR,861 bp的ORF,无内含子序列,编码286个氨基酸,α-苦瓜素蛋白含有RIP蛋白保守结构域。系统进化分析结果表明,除苦瓜RIP P16094.2外,α-苦瓜素蛋白与胶苦瓜3MRW_A的亲缘关系最近,而与苦瓜MAP30蛋白的亲缘关系较远。通过比较35份苦瓜种质资源α-苦瓜素基因序列,共发现5个SNP位点,5个SNP位点均位于编码区。SNP分组发现,35份苦瓜种质资源α-苦瓜素基因共存在5种单倍型。5种单倍型编码的氨基酸序列比对显示,共存在1个氨基酸变异位点,氨基酸变异位点对应于第5个SNP位点,第1、第2、第3、第4 SNP位点并未引起氨基酸的改变。该结果为进一步研究α-苦瓜素基因表达调控机制和不同单倍型编码蛋白功能差异奠定了基础。

苦瓜α-苦瓜素基因启动子克隆与单倍型分析

为探明α-苦瓜素基因的表达调控规律,从苦瓜种质Y5中克隆了α-苦瓜素基因上游包括起始密码子在内的1 620 bp序列,选取转录起始位点上游1 500 bp序列,利用Plant CARE在线启动子预测工具进行分析。结果表明,α-苦瓜素启动子除了含有TATA-box和CAAT-box等核心元件外,还含有光响应元件、赤霉素响应元件、热胁迫响应元件、干旱应答元件、水杨酸应答元件、茉莉酸应答元件等。以28份苦瓜种质为材料,分析了α-苦瓜素启动子区域SNP和In Del分布情况,共发现24个SNP位点和1个In Del,28份苦瓜种质资源共存在4种单倍型。3个SNP位于转录因子结合位点,可能对α-苦瓜素基因的表达调控有重要作用。

α-苦瓜素经LRP1受体介导的JNK信号通路诱导肝细胞L02早期凋亡的机制研究

目的:探讨α-苦瓜素诱导肝细胞L02(简称"L02细胞")早期凋亡的信号通路。方法:制备并纯化α-苦瓜素。采用流式细胞术检测0(阴性对照)、160、80μg/mLα-苦瓜素作用L02细胞2～8 h后的细胞凋亡率。小干扰RNA(siRNA)沉默低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)得到LRP1-siRNA细胞,然后采用液相芯片分析术检测α-苦瓜素(160μg/mL)分别作用L02细胞(正常组)和LRP1-siRNA细胞(沉默组)0、0.25、0.5、1、2 h后c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路中促调蛋白磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化凋亡前体蛋白(p-Bad)、胱天蛋白酶9(Caspase-9)及抑调蛋白磷酸化蛋白53(p-p53)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化B淋巴细胞瘤2(p-Bcl-2)、Caspase-8的表达情况,分析α-苦瓜素对L02细胞JNK信号通路的作用。结果:制备并纯化得到α-苦瓜素(纯度>97%);与阴性对照组比较,160μg/mLα-苦瓜素作用8 h时,可显著诱导细胞早期凋亡(P<0.05),80μg/mLα-苦瓜素诱导的早期凋亡不明显(P>0.05);与0 h比较,作用后0.25 h促调蛋白p-JNK、p-Bad和Caspase-9表达量显著增加(P<0.05),而抑调蛋白pp53、p-Akt、p-Bcl-2和Caspase-8表达量无变化;与正常组相比,沉默组各时间点的p-JNK、p-Bad和Caspase-9的表达均显著减少(P<0.05)。结论:α-苦瓜素可能通过LRP1受体介导JNK信号通路诱导肝细胞凋亡,为揭示其肝毒性提供了参考。

α-苦瓜素基因的克隆和原核表达

α-苦瓜素(Alpha-momorcharin)是一种多功能核糖体失活蛋白,具有抗肿瘤、抗HIV-1和抗菌活性,并同时具有免疫抑制活性。利用PCR(polymerase chain reaction)技术从苦瓜基因组中扩增出了成熟的α-苦瓜素蛋白基因,并亚克隆到表达载体pET28a(+)上,然后分别在BL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中进行表达。结果表明只在RosettaTM(DE3)pLysS中,重组α-苦瓜素基因能成功地表达出33kD大小的重组蛋白,而且在18℃和22℃的温度下,经IPTG诱导后,能成功地表达出大量可溶性重组蛋白。利用重组蛋白的N末端带有的6×His标签,通过Ni-NTA柱纯化获得了α-苦瓜素重组蛋白。Western杂交实验表明,纯化后的重组蛋白可与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应。α-苦瓜素重组蛋白的获得为进一步系统研究和改造其功能与活性奠定了基础。

苦瓜素类似物的分离纯化及其性质研究

本文采用硫酸铵分级沉淀、亲和层析、凝胶过滤等方法,从苦瓜(Momordicacharantia)种仁分得苦瓜素Ⅰ、Ⅱ。它们在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳上均呈现单一区带,其分子量分别为26 000和28 000,等电点8.3,含糖量1.6％和2.0％。苦瓜素Ⅰ对小鼠腹腔给药LD_(50)值为2.54mg/kg,苦瓜素Ⅱ的致死剂量范围是9-14mg/kg。它们对无细胞体系蛋白合成都有强烈的抑制活性,其IC_(50)均小于0.1ng/mL。我们将苦瓜素Ⅰ、Ⅱ与文献报道的苦瓜抑制剂(Momordica chanantiainhibitor,MCI)和α、β-momorcharin进行了比较,发现它们分别与MCI和α-momorcharin相似。由于苦瓜素Ⅱ的毒性较低,更适合于制备免疫毒素。

碱法提取苦瓜素工艺优化

[目的]优化碱法提取苦瓜素工艺。[方法]以提取液中苦瓜素含量为指标,通过单因素试验及正交试验确定提取苦瓜素的最佳提取工艺。[结果]得到提取工艺各因素的最佳水平为A2B2C3D2,即料液比为1∶5,提取温度为80℃,NaOH浓度为0.4 mol/L,浸提时间为2 h。[结论]实际生产中考虑生产周期的因素可将提取时间调整为1 h。

苦瓜素性质及其生理功能研究概况

苦瓜素作为一种功能性活性物质,具有很大发展潜力。该文概述苦瓜素的分离纯化,理化性质,生理功能和作用机理。

α-苦瓜素通过激活JNK信号通路诱导口腔鳞癌细胞凋亡的机制研究

目的:探讨α-苦瓜素(α-MMC)对口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞的增殖抑制作用及通过激活细胞信号传导通路调控细胞凋亡的分子机制。方法:通过CCK-8法检测α-MMC对HSC-3细胞的增殖抑制作用;利用PI、Annexin V-FITC/PI、JC-1染色及流式细胞术测定α-MMC对HSC-3细胞周期、凋亡、线粒体膜电位的影响;通过蛋白免疫印迹技术判断α-MMC作用后,HSC-3细胞凋亡相关蛋白及信号通路蛋白的表达情况。结果:CCK-8分析结果显示,α-MMC以药物浓度和时间梯度依赖的方式抑制HSC-3细胞增殖,其24 h和48 h的IC50值分别为50.38μg/mL和20.17μg/mL;流式细胞术检测发现,α-MMC阻滞HSC-3细胞周期于G2/M期,降低细胞线粒体膜电位,诱导细胞凋亡;蛋白免疫印迹结果显示,α-MMC上调促凋亡蛋白Bim表达,下调抗凋亡蛋白Mcl-1的表达;激活JNK信号通路,即上调p-MKK4、p-JNK、p-c-Jun的表达水平。结论:α-MMC对口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞具有增殖抑制作用,其机制可能是α-MMC激活JNK信号通路触发细胞周期阻滞,并通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

α苦瓜素对大鼠长期毒性实验的血液学指标分析

目的探讨长期毒性实验中α苦瓜素(α-MMC)对大鼠的血液学影响。方法将SD大鼠随机分为生理盐水对照组、α苦瓜素各剂量组(6.25,2.08,0.70mg/kg),隔日经尾静脉注射给药一次,连续28天,停药后恢复14天,分别在给药期末和恢复期末进行血液常规检查、流式细胞分析和骨髓象检查。结果连续给予大鼠α苦瓜素28天后,随着剂量的增加,WBC、LYM、RBC、HGB逐渐减少,NEU和PLT则逐渐增多。经过14天的恢复期,各血液学指标的异常变化有所改善。结论长期给予α-MMC会引起大鼠以血细胞数量变化为主的血液学毒性变化。

β-苦瓜素的结构分析与表位预测

采用生物信息学方法、神经网络算法、量化矩阵法和隐式马尔可夫模型,分析β-苦瓜素蛋白的空间结构,预测其信号肽、B细胞抗原表位、细胞毒性T细胞表位、主要组织相容性复合物分子结合肽,对β-苦瓜素蛋白序列作预测打分。得出β-苦瓜素启始部有一段22个氨基酸构成的信号肽,分布着6个B细胞表位,3个CTL表位,序列71-79的HLA限制性CTL表位结合力最高,3段共有MHC-Ⅰ类分子结合肽,2段共有MHC-Ⅱ类分子结合肽。可为研究β-苦瓜素调控免疫、抗癌机理提供依据。