苦蘵化学成分及抗炎活性研究

研究苦蘵的化学成分及抗炎活性。采用硅胶、Sephadex LH-20和ODS等柱色谱分离技术对苦蘵乙酸乙酯部位进行分离纯化,通过波谱学技术鉴定化合物结构,并采用LPS诱导的RAW264.7释放NO的细胞模型,评价化合物的体外抗炎活性。从苦蘵中分得13个化合物:5,4′-二羟基-3,3′,7-三甲氧基-黄酮(1)、3β-hydroxy-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-diene(2)、(22R)-5β,6β∶14α,17∶14β,26-triepoxy-2α-ethoxy-13,20,22-trihydroxy-1,15-dioxo-16α,24-cyclo-13,14-secoergosta-18,27-dioic acid 18→20,27→22-dilactone(3)、alkesterol B(4)、withaminilide F(5)、酸浆苦素B(6)、酸浆苦素D(7)、酸浆苦素U(8)、withaphysalin R(9)、rel-(18R,22R)-5β,6β∶18β,20-diepoxy-3β,18α-dimethoxy-4β-hydroxy-1-oxowith-24-enolide(10)、withaphysalin P(11)、β-谷甾醇(12)、棕榈酸(13)。化合物1和2首次从酸浆属中分离得到,化合物3~5、10、11首次从该植物中得到。体外抗炎结果表明,化合物5、6、10、11抗炎效果显著。

HPLC法测定苦蘵中酸浆苦味素D的含量

建立了一种测定苦蘵中酸浆苦味素D含量的高效液相色谱法.采用Waters Symmetry C_(18)(4.6×250mm,5μm)色谱柱,以流动相为乙腈-水(25∶75);检测波长为227nm;柱温为25℃.结果表明:酸浆苦味素D浓度在10~100μg·mL^(-1)浓度范围呈良好的线性关系(r=0.999 8),平均加样回收率(n=3)为98.7%,RSD为1.8%.说明本方法简便、准确、重复性好,可用于苦蘵药材的质量控制.

苦蘵多糖的提取及体外抗氧化活性的研究

目的研究苦蘵多糖的醇沉条件及其体外抗氧化活性。方法经超声提取,除脂,除蛋白等工艺得到苦蘵粗多糖,并考察了醇沉条件(醇沉比、温度、pH、时间、浓缩比)对多糖沉淀的影响。采用体外实验研究了苦蘵多糖对·OH和DP-PH的清除作用及对大鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用。结果在最佳的醇沉条件(浓缩比4∶1,温度-20℃,醇沉时间16h,醇沉比为1∶4,pH为7)下,多糖提取率为3.15%。多糖对大鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制率可达80%,对·OH和DPPH也都有很好的清除作用。结论苦蘵果实中多糖有良好的体外抗氧化活性。

苦蘵化学成分及药理作用研究进展

苦蘵是中国民间药用植物,主要化学成分为甾体类、甾醇类、有机酸类、多糖类、黄酮类化合物等.现代药理研究证明其具有抗癌、免疫调节、抗炎、抗氧化、抗菌等活性.文章就国内外近年来对苦蘵的化学成分、药理作用的研究进展进行综述,为其进一步的深入研究与开发利用提供参考.

苦蘵毛状根体系的建立

为建立苦蘵毛状根体系,分别考察了菌株类型、外植体、培养基类型、侵染时间对苦蘵毛状根诱导率的影响,并对毛状根进行了PCR检测.结果表明:采用MS固体培养基,发根农杆菌C58C1侵染苦蘵叶片的毛状根诱导率可达81.2%.通过PCR鉴定,进一步证实C58C1 Ri质粒上的rolB和rolC基因片段已成功转入被侵染的苦蘵叶片中,所获得的毛状根为发根农杆菌诱导生成.

苦蘵P450家族基因鉴定与表达分析

细胞色素P450酶(cytochrome P450)广泛参与植物次生代谢,是当前的研究热点。基于苦蘵转录组数据,分析并鉴定了部分苦蘵P450家族基因。共鉴定得到795个可能为P450家族基因的序列片段,并将它们聚类到25个不同的聚类(cluster)中,其中,有12个聚类具有组织特异性表达。最终拼接得到30个苦蘵P450家族基因的全长序列,它们与其他物种P450基因高度同源。进化分析表明,这30个苦蘵P450基因可归为9个P450亚家族。通过定量PCR技术,分析了多个P450基因在果实不同成熟阶段的表达变化。结果表明,9个P450基因随着果实成熟表达量上升,另外9个P450基因表达量则逐渐降低。以果实为材料,分析了P450家族基因在乙烯(ACC)与乙烯抑制剂(1-甲基环丙烯,1-MCP)处理下的表达变化。研究表明,部分P450家族基因在ACC和1-MCP处理下表现出相反的表达模式,这说明P450可能参与乙烯介导的果实成熟过程。克隆了3个果实特异表达的P450家族基因(comp164210、comp131532、comp152181),它们主要定位于细胞质和细胞膜中。本研究为苦蘵药用性状遗传改良提供了有价值的遗传信息。

苦蘵组织培养技术初探

为建立药用植物苦蘵稳定高效的组织培养体系,以苦蘵的子叶为外植体进行离体培养,对培养条件进行探索和优化.结果表明:苦蘵种子在1/2 MS培养基中萌发可培养出适于后续试验的健康子叶;诱导愈伤组织和不定芽的最佳培养基为含6-BA(3 mg/L)和NAA(0.05 mg/L)的MS培养基,其愈伤组织诱导率达100%,从愈伤组织诱导不定芽率最高达78%;将生长良好的2~3cm的不定芽接种到1/2 MS生根培养基中,两周左右可形成较好的根系,生根率可达100%.

苦蘵查尔酮合成酶编码基因(PaCHS1)的克隆及表达谱分析

对苦蘵(Physalis angulata L.)成分药理研究的结果表明,苦蘵果实内存在有效抑制肿瘤细胞生长的活性成分。查尔酮合成酶(CHS)在植物黄酮类物质次生代谢过程中起到了重要作用。本研究利用同源克隆的方法获得了苦蘵CHS基因的全长c DNA序列,命名为Pa CHS1。序列分析表明,克隆得到的苦蘵Pa CHS1基因全长为1 170 bp,编码389个氨基酸。生物信息学分析表明,Pa CHS1是一个不含核定位序列且定位于细胞质和细胞膜为主的蛋白。实验数据也证实了Pa CHS1是一个细胞膜和细胞质定位的蛋白。序列对比显示其与多种植物的CHS蛋白序列高度同源,尤其与小金鱼草的Mo CHS1亲缘关系最近。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织器官中,Pa CHS1均有表达且表达水平有差异。Pa CHS1在果实中表达水平最高,而在茎中的表达水平最低。我们又分析了Pa CHS1基因在不同激素处理下的表达变化,结果表明,Pa CHS1基因的表达水平受到不同激素的调控,茉莉酸(JA)对Pa CHS1有强烈的诱导作用,而赤霉素(GA)、乙烯(ethylene)和细胞分裂素(cytokinin)对Pa CHS1有强烈抑制作用。对苦蘵Pa CHS1基因的克隆和表达图谱研究,可为研究苦蘵以黄酮类物质为代表的次生代谢途径打下基础。

UPLC-MS/MS法测定苦蘵宿萼中physalin H和physalin D的含量

建立了同时测定苦蘵中2种酸浆苦味素类化合物含量的方法.应用超高效液相色谱(UPLC)与Qtrap质谱(MS)联用同时测定苦蘵中酸浆苦味素H(physalin H)和酸浆苦味素D(physalin D)2个成分的含量.采用Waters Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱,以水(0.1%甲酸)-乙腈(0.1%甲酸)为流动相,梯度洗脱,柱温35℃,流速0.3 mL·min^(-1),使用ESI+离子源,多反应监测(MRM)模式扫描,对physalin H和physalin D进行定量.结果表明physalin H和physalin D在5~10000 ng·mL^(-1)范围内具有良好的线性关系,相关系数(r)分别为0.9997和0.9995;平均加样回收率(n=5)分别为71.1%和71.0%,RSD值分别为1.36%和1.47%.该方法准确可靠,可用于苦蘵药材中physalin H和physalin D的含量测定,为有效控制苦蘵药材的质量奠定了基础.

苦蘵育种F_1群体真伪鉴定

目的:研究苦蘵育种F_1群体真伪。方法:以浙江临海和浦江两个种源的苦蘵为亲本,对获得的85个杂交F_1代,利用200对全基因组SSR标记进行杂交后代真伪鉴定。结果:筛选出2对可进行苦蘵F_1代个体杂种鉴定的特异性SSR标记SSR0959和SSR0116。其中利用这两对SSR标记证实本研究构建的苦蘵杂交F_1代群体的85个单株均为双亲互补型(真杂交种)。结论:通过SSR分子标记技术可以快速、准确的鉴定出苦蘵杂交群体中的真杂交种,为后续苦蘵高密度遗传连锁图谱的构建以及有效成分的QTL定位研究奠定基础。

苦蘵内酯J降解STAT3蛋白诱导H1975细胞凋亡的作用机制

[目的]探索信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)新型抑制剂苦蘵内酯J诱导肺腺癌细胞凋亡的分子机制。[方法]以5、10、20、25、30、40μmol·L^(-1)苦蘵内酯J处理表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)T790M继发突变的肺腺癌细胞株H1975细胞24h或48h后,CCK-8法检测细胞存活率;5、10、15、20μmol·L^(-1)苦蘵内酯J处理H1975细胞24h后,Annexin V-PI染色及流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达;5、10、15、20μmol·L^(-1)苦蘵内酯J处理H1975细胞4h或20μmol·L^(-1)苦蘵内酯J处理H1975细胞0.5、1、2、4h后,Western blot检测STAT3蛋白表达及其磷酸化水平;以20μmol·L^(-1)蛋白酶体抑制剂MG132及10μmol·L^(-1)苦蘵内酯J联合处理或单独处理H1975细胞,阐明苦蘵内酯J对STAT3蛋白的降解作用;20μmol·L^(-1)苦蘵内酯J处理H1975细胞4h后,实时荧光定量PCR检测STAT3 m RNA表达情况。[结果]H1975细胞存活率随苦蘵内酯J作用时间延长和作用浓度增加而不断降低,20μmol·L^(-1)苦蘵内酯J处理24h和48h,H1975细胞存活率分别为65.9%和44.2%;20μmol·L^(-1)苦蘵内酯J处理24h后,H1975细胞凋亡率为51.1%;Western blot检测显示20μmol·L^(-1)苦蘵内酯J处理24h后,H1975细胞内cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3和cleaved-PARP蛋白表达水平显著高于未处理组(P<0.05,P<0.01,P<0.001);20μmol·L^(-1)苦蘵内酯J处理4h后,H1975细胞内STAT3总蛋白和STAT3-Tyr表达水平显著低于与未处理组(P<0.001);蛋白酶体抑制剂MG132可恢复STAT3的总蛋白水平;实时荧光定量PCR结果显示,苦蘵内酯J对STAT3 m RNA表达无影响(P>0.05)。[结论]苦蘵内酯J能够抑制H1975细胞增殖并诱导细胞凋亡,其可能的机制是引起STAT3泛素化降解并抑制STAT3磷酸化。

苦蘵中睡茄交酯类成分的抗炎靶标预测

目的应用分子对接技术预测苦蘵中睡茄交酯类成分的抗炎活性靶标,并利用LPS诱导细胞炎症模型验证化合物的体外抗炎活性。方法以计算机辅助药物设计(CADD)中的分子对接技术为研究方法,以前期从苦蘵分离鉴定的9个睡茄交酯类成分组成配体数据库,选择环氧合酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、细胞外调节激酶(ERK)、p38、应激活化蛋白激酶(JNK)、核转录因子(NF-κB)等6个与抗炎活性密切相关的靶点组成受体数据库,对睡茄交酯类化合物的作用靶点及抗炎机制进行预测,进一步利用细胞炎症模型验证化合物对LPS诱导巨噬细胞释放炎症介质一氧化氮(NO)的抑制活性。结果对比分析了9个睡茄交酯化合物作用于各靶点的主要活性位点,化合物1-4均对LPS诱导细胞释放NO表现出抑制活性。结论苦蘵中睡茄交酯类活性成分可能是通过阻断ERK信号转导途径来发挥抗炎作用。

药食两用模式植物苦蘵基因功能研究方法的建立

苦蘵中的酸浆苦素R可能有抗癌功效,基因组测序结果预测其生源代谢合成途径缺失环节可能分布于3个基因家族的89个相关同源基因里,这给其药效成分的生源合成阐明带来困难.本实验构建了由植物病毒介导的苦蘵基因功能研究体系,应用狗尾草花叶病毒(Foxtail mosaic virus,FoMV)来实现相关外源基因(eGFP)的稳定表达;同时,基于烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)建立苦蘵的功能基因表达沉默技术,实验中有效地抑制苦蘵内源的八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的表达水平.该方法可对候选基因实现差异化表达,对上下游的相关性基因进行分析,可以用于苦蘵的功能基因筛选和鉴定.

苦蘵总黄酮的提取及含量测定

以提取苦蘵总黄酮含量为评价指标,乙醇体积分数、料液比、提取时间为考察因素,采用正交试验法确定总黄酮的最佳提取工艺。结果表明,最佳工艺为乙醇体积分数30%,料液比1∶60,提取时间60 min。芦丁在0.1~0.5 mg·mL^(-1),线性关系良好(r=0.999 5),平均回收率为98.0%,相对标准偏差1.00%。所确定的提取工艺简单、易于操作、提取率高,可用于苦蘵总黄酮的测定。

苦蘵的化学成分研究

目的研究苦蘵(Physalis angulata L.)全草的化学成分。方法利用色谱方法分离和纯化化合物,并通过光谱方法及理化性质鉴定其结构。结果从苦蘵中分离获得13个化合物,分别鉴定为酸浆苦素A(1)、酸浆苦素B(2)、酸浆苦素E(3)、酸浆苦素P(4)、豆甾-5-烯-3β-醇(5)、麦角甾-5,24(28)-二烯-3β-醇(6)、菜籽甾醇(7)、豆甾烷-22-烯-3,6-二酮(8)、孕甾-5-烯-3-醇-20-羧酸(9)、麦角甾-5,24(28)-二烯-3β,23S-二醇(10)、麦角甾-5,25(26)-二烯-3β,24ξ-二醇(11)、正十六酸(12)、正十七酸(13)。结论除化合物2、3外,其余化合物均为首次从该植物中分离得到,化合物5~10、12~13首次从该属植物中获得。

苦蘵的化学成分及其细胞毒活性研究

目的对酸浆属植物苦蘵Physalis angulata的全草进行化学成分及肿瘤细胞毒活性研究。方法运用硅胶、Sephadex LH-20凝胶等柱色谱和HPLC等方法,并结合液质联用分析技术,采用活性跟踪的方法从苦蘵全草中分离细胞毒活性成分。根据理化常数测定和各种谱学(1D和2D NMR、MS)数据分析等鉴定化合物结构,MTT法测定化合物的细胞毒活性。结果从苦蘵全草的95%乙醇水提取物中共分离得到12个化合物,分别鉴定为酸浆苦素A(1)、酸浆苦素B(2)、酸浆苦素C(3)、酸浆苦素D(4)、酸浆苦素F(5)、酸浆苦素H(6)、酸浆苦素I(7)、5α-乙氧基-6β-羟基-5,6-二氢酸浆苦素B(8)、酸浆苦素O(9)、β-谷甾醇(10)、2-羧基苯胺羰酸甲酯(11)、2-(乙酰胺基)-苯甲酸(12)。结论化合物11为新天然产物,化合物1~3、9为首次从苦蘵中分得,化合物1~9为酸浆苦素类(physalins)甾体化合物。细胞毒活性实验结果显示,化合物1~9对肺癌细胞株A549均具有较强的增殖抑制活性,其中以2、3、6、8的抑制活性最为显著,其IC50值为1.9~20.2μmol/L。

“靶点+活性”快速发现苦蘵中靶向Hsp90抗胰腺癌有效成分的研究

本研究基于"靶点+活性"双重导向快速发现技术筛选苦蘵中靶向Hsp90蛋白杀伤胰腺癌细胞的活性单体。通过将体外抗肿瘤活性筛选技术、双萤光素酶报告基因技术与多元色谱分离技术相耦合,从中药苦蘵中筛选靶向Hsp90的活性单体。研究化合物抗胰腺癌细胞BXPC-3生长活性,初步探讨化合物抑制Hsp90分子机制。结果显示从苦蘵中分离得到醉茄内酯类化合物withanolide E (WE)与4β-hydroxywithanolide E (HWE)。MTT结果显示,WE与HWE处理BXPC-3细胞48 h的半数抑制率(IC_(50))分别为0.71±0.03和1.23±0.10μmol·L^(-1);萤光素酶报告基因实验结果显示, WE与HWE可使细胞热休克元件活性增强12.5±3.4倍与28.1±3.4倍;两者均呈现量效与时效关系。分子机制研究提示,与DMSO组相比5μmol·L^(-1) WE和HWE分别处理BXPC-3细胞48 h可诱导Hsp90二聚体蛋白表达上调6.5±1.3和11.8±2.0倍, Hsp90客户蛋白Akt表达下调至DMSO组的21.7%±2.8%和9.8%±1.4%; shRNA干扰Hsp90基因表达可阻断其抑制Akt表达与杀伤肿瘤细胞的作用。采用"靶点+活性"双重导向快速发现技术可从苦蘵中筛选得到靶向Hsp90蛋白杀伤胰腺癌细胞的活性单体WE与HWE;其分子机制可能与诱导胰腺癌细胞形成无活性Hsp90二聚体,进而抑制Hsp90客户蛋白Akt表达有关。

苦蘵内生真菌Trichoderma harzianum的次级代谢产物

目的:研究茄科酸浆属植物苦蘵(Physalis angulata)的内生真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的次级代谢产物。方法:菌株采用震荡培养箱扩大培养,得到的菌液用乙酸乙酯等体积萃取3次,菌丝体则以丙酮浸泡超声,回收溶剂后将所得提取物合并,再经液相-质谱联用技术,开放ODS反相柱色谱,LH-20羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱(sephadex LH-20),高效液相色谱等方法进行成分的分析与分离纯化活性次级代谢产物。利用其理化性质和光谱数据(1H-NMR,13C-NMR)等鉴定化合物结构。采用噻唑蓝(MTT)法测定化合物的细胞毒性。结果:从苦蘵内生真菌哈茨木霉中分离得到10个次级代谢产物,分别鉴定为destruxin A2(1),destruxin B2(2),环(亮-脯)二肽(3),环(苯丙-脯)二肽(4),cyclonerodiol(5),brevianamide F(6),N-乙酰色胺(7),9-羟基-邻苯二甲酸二异丁基酯(8),5-羟基-3-羟甲基-2-甲基-7-甲氧基色酮(9)和苯丙酸(10)。细胞毒性试验结果显示,化合物1~10对肺癌细胞株A549均未表现出显著的细胞毒性(半抑制浓度≥20 mg·L^-1)。结论:化合物1~10均首次从哈茨木霉中分离得到。

苦蘵睡茄内酯提取物下调YAP和TGF-β/Smad通路抑制肝星状细胞激活改善小鼠肝纤维化

肝纤维化是慢性肝损伤的常见瘢痕反应,细胞外基质的过度积累是其主要特征,其中肝星状细胞的过度激活是肝纤维化发生的关键步骤。苦蘵睡茄内酯提取物(the withanolide extract of Physalis angulata, WEP)是从中药苦蘵(Physalis angulata L.)中提取富集的部位,主要含有酸浆苦素型的睡茄内酯类化合物。本实验通过建立四氯化碳及胆总管结扎诱导的小鼠肝纤维化模型,以及转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)处理诱导的人肝星状细胞LX-2活化模型,结合不同浓度的WEP处理,研究WEP对肝纤维化的治疗作用,并探讨潜在的作用机制。本文中所有动物实验都获得中国药科大学伦理学委员会批准。动物实验结果显示,与模型组相比, WEP可降低血清中谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)和谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)水平,减轻肝损伤,显著降低胶原沉积,改善肝纤维化水平。WEP对LX-2细胞无明显细胞毒性,但可显著降低肝纤维化标志物Ⅰ型胶原α1 (collagen typeⅠα1 chain, COL1A1)及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的mRNA和蛋白表达,抑制肝星状细胞活化。在体内外模型中, WEP可抑制yes相关蛋白(yes-associated protein, YAP)的表达及Smad家族蛋白2 (Smad family member 2, Smad2)的磷酸化水平。综上, WEP可通过下调YAP和TGF-β/Smad通路抑制肝星状细胞活化,在体内外表现出良好的抗肝纤维化活性。

酸浆苦素B、E抗炎、抗菌作用实验研究

目的观察酸浆苦素(physalin)B和E的抗炎、抗菌作用。方法采用二甲苯致小鼠耳肿胀的试验方法,考察酸浆苦素B和E对小鼠的耳缘肿胀率的影响;采用体外抑菌试验,观察酸浆苦素B、E对乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、卡塔球菌的抑制作用。结果酸浆苦素B对二甲苯致小鼠耳肿胀具有极显著的抑制作用,酸浆苦素E对二甲苯致小鼠耳肿胀具有明显的抑制作用。酸浆苦素B、E具有良好的抑菌作用,酸浆苦素B对乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、卡塔球菌的最低抑菌浓度分别为6.25、25、200、200、400μg/m L。酸浆苦素E对乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、卡塔球菌的最低抑菌浓度分别为50、50、400、400、800μg/m L,酸浆苦素B较之酸浆苦素E抗菌活性更强。结论酸浆苦素B和E具有一定的抗炎、抗菌作用,酸浆苦素B活性较酸浆苦素E强。