苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化

以不同浓度的苯并 (a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)多次处理人支气管上皮细胞 16HBE ,并观察转化细胞的恶性特征。发现BPDE可诱导 16HBE细胞恶性转化 ,形成转化灶。转化灶细胞失去接触抑制 ,排列紊乱 ,无方向性 ,交叉重叠生长。转化的细胞可在软琼脂上生长 ,各浓度处理组细胞集落形成率均显著高于对照组 ,有良好的剂量—反应关系。经BPDE处理的细胞在裸鼠体内成瘤 ,病理学诊断为鳞状细胞癌。本实验以反式BPDE成功地诱发了人支气管上皮细胞恶性转化 ,为后期进一步研究其致癌的分子机制、寻找致癌相关基因提供了理想的生物学材料。

二羟环氧苯并芘诱导转化与翻译延长因子的关系

目的探讨真核翻译延长因子1α1(eTEF1α1)基因在反式二羟环氧苯并芘致癌机制中所起的作用。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增真核翻译延长因子1α1基因全长,插入pcDNATM3.1 D irectional TOPO表达载体,以脂质体转染介导的技术和G418细胞筛选法转染人支气管上皮细胞,构建转基因稳定表达的细胞株。用半定量RT-PCR方法分析转基因表达产物,对转基因细胞株,进行双层软琼脂试验以确定基因的恶性特性。结果成功扩增出eTEF1α1基因全长,构建出稳定表达真核翻译延长因子1α1基因的细胞株。稳定转染eTEF1α1基因的细胞株,能在双层软琼脂中形成克隆。结论真核翻译延长因子1α1基因与反式二羟环氧苯并芘的恶性转化有关。

二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响

目的探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响。方法利用RT-PCR和Western blot方法,分别检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中mRNA和蛋白表达水平的变化。利用免疫细胞化学方法检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中定位和蛋白表达量的变化。结果RT-PCR和Western blot实验表明,BPDE恶性转化细胞N-Ras基因的mRNA和蛋白水平分别是正常细胞的3.616和1.600倍。免疫细胞化学实验显示,在BPDE恶性转化细胞和正常细胞中,N-Ras基因在细胞膜和细胞浆中均有表达,且两者相比,前者中的N-Ras蛋白表达明显强于后者。结论N-Ras基因可能在BPDE的致癌机制中起着重要作用。

Ras基因家族在二羟环氧苯并(a)芘恶性转化细胞中的表达研究

目的检测环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞Ras基因家族表达的影响。方法以正常人支气管上皮细胞为对照组,经BPDE恶性转化人支气管上皮细胞为实验组,分别利用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法,检测Ras基因家族在mRNA和蛋白水平表达变化。结果RT-PCR实验表明,BPDE恶性转化细胞H-Ras、K-Ras和N-Ras mRNA表达水平分别是正常细胞的2.237、1.254和3.616;Western blot实验显示,H-Ras、K-Ras和N-Ras蛋白表达量分别是正常细胞的1.273倍、1.547和1.600倍;免疫细胞化学实验表明,恶性转化细胞H、K和N-Ras蛋白表达明显强于正常细胞。结论BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在H-Ras、K-Ras和N-Ras基因过表达。

二羟环氧苯并芘致肺癌相关基因筛选

目的筛选与二羟环氧苯并芘,(BPDE)引发肺癌相关基因的DNA片段,为进一步探讨BPDE致癌机制提供研究依据。方法应用扩增片段长度多态性(AFLP)结合免疫磁珠分离等技术对与BPDE相互作用的DNA片段进行富集、扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示差异片段,并对其回收、克隆、测序及同源相似性比对分析。结果成功回收了差异片段,经测序得到其碱基序列,基因同源相似性比对分析发现,有8条序列与已知基因同源,另有1条序列未找到同源序列,将该序列向GenBank提交注册,GenBalak已接受并给予登录号为:EF176681。结论AFLP结合免疫磁珠分离等技术可以用于化学致癌BPDE肿瘤易感基因的筛选,所得9条基因片段可能与BPDE引发肺癌有关。

抑制性消减杂交技术检测反式二羟环氧苯并芘转化细胞与正常细胞基因表达差异

目的 筛选 7,8 二羟 9,10 环氧苯并芘 (BPDE)转化细胞与正常细胞的基因表达差异。方法 以BPDE转化支气管上皮细胞 (16HBE)细胞为检测子 (tester) ,正常 16HBE细胞为驱动子 (driver) ,应用抑制性消减杂交方法构建cDNA消减文库 ,经 2次消减杂交和 2次PCR后 ,将巢式PCR产物插入TA载体克隆 ,随机挑选克隆进行鉴定和测序 ,并用斑点杂交法验证其同源性 ,将所得序列进行GenBank的BLAST分析。结果 发现了 7个在BPDE转化细胞中高表达的基因 ,为翻译延长因子 1α1、线粒体基因、溶解物载体家族 2 5、EphA2、酪氨酸 3 加单氧酶 色氨酸 - 5 -加单氧酶活化蛋白、乳酸脱氢酶A、TRIM2 8等 ,尚有一条在GenBank的已知基因中找不到对应序列 ,在EST序列中找到全长对应序列。结论 发现的高表达基因可能在BPDE的致癌机制中起作用 ,另外 ,可能有未知基因与BPDE的恶性转化作用有关。

反式二羟环氧苯并(a)芘-DNA加合物在肺癌发病中的作用

[目的]反式二羟环氧苯并 (a)芘 (BPDE)为苯并 (a)芘在体内的代谢产物 ,是一种直接的致癌物 ,可攻击DNA形成BPDE_DNA加合物 ,本研究目的为探明该加合物在人群肺癌发生中的作用及其分子机制。[方法]使用针对BPDE_DNA加合物的单克隆抗体 ,通过免疫学方法检测150例肺癌、120例癌旁肺组织、40例肺良性病变和40例正常肺组织中BPDE_DNA加合物的含量 ,同时检测相应肺组织中P53、C_MYC、K_ras、BCL_2、hTERT等癌变相关基因的表达 ,分析BPDE_DNA加合物与上述基因的关系。并在BPDE诱导的体外人气管上皮细胞癌变模型上检测癌变过程中BPDE_DNA加合物的变化。[结果]82.0 % (123/150)的肺癌组织 ,37.5 % (45/120)的癌旁肺组织 ,15.0% (6/40)的肺良性病变和2.5% (1/40)的正常肺组织可检出BPDE_DNA加合物 ,肺癌组织中加合物的含量显著高于其他肺组织 ,P<0.01。分层分析发现男性肺癌病例加合物检出率为89.9% (107/119)高于女性的检出率51.6 % (16/31) ,P<0.05。有吸烟史的肺癌患者加合物检出率为99.1% (113/114)高于非吸烟肺癌患者的27.8% (10/36),P<0.01。肺癌组织P53、K_ras、BCL_2基因的阳性表达与BPDE_DNA加合物有关联 ,而C_MYC、hTERT基因的表达与BPDE_DNA加合物无关联。在体外用BPDE作用于人气管上皮细胞系 ,可诱导?

反式二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞中HER2/neu基因表达的影响

目的探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞HER2/neu基因表达的影响。方法利用半定量RT-PCR、SYBR GreenI实时定量RT-PCR(QRT-PCR)、Western blot及免疫细胞化学方法分别检测经2.0μmol/L反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化细胞(16HBE-T)与对照DMSO溶剂组未恶性转化细胞(16HBE-N)之间HER2/neu基因mRNA和蛋白表达水平的差异,及两组细胞内HER2/neu蛋白表达定位分析。结果经几种不同方法检测反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞中HER2/neu基因mRNA和蛋白水平都比对照溶剂组细胞(16HBE-N)表达显著升高(P<0.05)。HER2/neu蛋白定位在胞膜。结论反式BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在HER2/neu表达增高,其可能与原癌基因HER2/neu被激活作用有关。

反式二羟环氧苯并(a)芘所致人支气管上皮细胞POLK基因高表达

目的观察不同剂量反式二羟环氧苯并(a)芘(anti-BPDE)处理对人支气管上皮细胞(16HBE)POLK基因表达的影响。方法分别以0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L的反式-BPDE1次或3次处理16HBE细胞,采用TaqmanMGB探针实时定量聚合酶链反应方法相对定量POLK和POLZ基因表达,同时对反式-BPDE转化的16HBE及肺癌H1299细胞POLK基因表达进行了分析。结果反式-BPDE1次处理及3次处理可诱导正常16HBEPOLK基因高表达。反式-BPDE转化16HBE和肺癌H1299细胞POLK基因表达明显增高,分别是正常16HBE的2.25和5.49倍。结论反式-BPDE处理可致16HBEPOLK基因高表达。

二羟环氧苯并芘恶性转化细胞miR-10a及其靶基因HOXA1的表达改变

目的检测二羟环氧苯并芘恶性转化细胞miR-10a表达水平,探讨其与靶基因HOXA1癌基因的关系。方法以正常支气管上皮细胞为对照组,二羟环氧苯并芘恶性转化细胞为实验组,用茎环结构逆转录引物逆转录,定量PCR检测两组细胞miR-10a表达水平。运用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、定量PCR和流式细胞术间接法检测2组细胞HOXA1 mRNA和蛋白表达水平。结果二羟环氧苯并芘恶性转化细胞miR-10a表达水平是对照组的0.01倍,RT-PCR HOXA1 mRNA是对照组的(3.12±0.23)倍,定量PCR HOXA1 mRNA是对照组的8.75倍,HOXA1蛋白表达是对照组的3.48倍。结论二羟环氧苯并芘恶性转化细胞miR-10a可能反向调控靶基因HOXA1的表达。

cDNA代表性差异分析法筛选二羟环氧苯并芘致癌相关基因片段

目的 采用cDNA代表性差异分析法 ,分离二羟环氧苯并芘诱导恶性转化的细胞与对照组细胞之间的差异表达基因。方法 先从细胞中提取mRNA并合成双链cDNA ,双链DNA以Sau3AI内切酶消化 ,连接接头并经PCR扩增。以BPDE诱导恶变细胞的cDNA为“检测子”、以对照组细胞cDNA为“驱赶子”进行消减杂交。结果 经 3轮消减杂交后分离出 5个cDNA片段 ,在琼脂糖凝胶上清晰显示 2 10bp以下的 5条条带 ,这些片段分别与总RNA作Northern印迹杂交证实它们均来自BPDE诱变的细胞。结论 cDNA代表性差异分析法是筛选化学致癌相关基因的有效。

二羟环氧苯并芘诱导16HBE细胞转化最佳实验方案

目的 采用客观又简单的软琼脂细胞集落形成率的指标来探索二羟环氧苯并芘诱导 16 HBE细胞转化的理想实验方案 ,构建恶性转化的细胞模型。方法 根据细胞存活率试验及克隆形成率试验确定诱导的剂量 ,以不同剂量二羟环氧苯并芘 1次或多次处理细胞 ,观察培养的不同阶段转化灶出现情况 ,用软琼脂培养鉴定其锚着依存性生长的恶性特征 ,比较各组转化细胞的集落形成率。结果 以 0 .1、0 .5、1.0、2 .0 μmol/ L的剂量 ,对细胞多次间断染毒 ,传代 15次 ,是二羟环氧苯并芘诱导 16 HBE细胞恶性转化的理想方案 ,其集落形成率分别为 2 .0‰、5 .5‰、7.0‰、10 .5‰ ,剂量 -反应关系呈现良好的直线相关 ,r=0 .9741,P<0 .0 5。结论 二羟环氧苯并芘能诱导人支气管上皮细胞 16 HBE转化 。

反式二羟环氧苯并(a)芘相关新基因brg的全长克隆

背景与目的:在前期研究中发现,16HBE-C细胞表达变化的基因中有未知基因参与,因其与BPDE有关,所以命名为brg(anti-BPDErelatedgene)基因。本研究应用cDNA末端快速扩增法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)扩增此未知基因的全长,以进行下一步的基因功能研究。材料与方法:应用cDNA末端快速扩增法(RACE技术),对3'和5'端分别设计了梯度PCR,巢式PCR等优化程序,以获得特异的产物,然后对特异产物直接测序,将测序结果进行生物信息学分析,基因拼接等获得新基因brg全长。结果:3'和5'端均成功获得特异性产物,3'RACE测序为394bp,有明显的PolyA加尾信号,有编码区的终止密码子;5'RACE测序为1017bp,有起始密码子ATG,其中197bp为3'和5'全长共有序列。将3'和5'序列拼接,结果全长1214bp,生物信息学分析brg基因阅读框1032bp,编码344个氨基酸。结论:所得结果与设计一致,说明所采用的技术路线是简便可行的,brg基因可能在反式二羟环氧苯并(a)芘的致癌机制中起重要作用。

恒波长同步荧光同时测定1，2-苯并蒽、苯并[K]芴和3．4，8．9-二苯并芘

为检测多环芳烃，采用了1，2-苯并蒽（1，2-BA）、苯并[K]芴（BkF）和3．4，8．9-二苯并芘（DBP）恒波长同步荧光分析法，选择波长差△λ=30nm，只需一次扫描，就可实现3组分的同时鉴别和定量测定．该方法简便、快速、灵敏，无需预分离，用于自来水、海水和溪水的分析，取得了良好的效果．

miR-493-5p在反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导恶变细胞中的功能研究

目的:探讨在反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导转化的人支气管上皮细胞(16HBE-T)中低表达的mir-493-5p在化学致癌物致癌过程中的作用。方法:运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证miR-493-5p成熟体在16HBE-T和非转化对照细胞(16HBE-N)的表达水平。瞬时转染miRNA的模拟物,改变16HBE-T中miR-493-5p的表达,检测转染后16HBE-T细胞的增殖能力。结果:16HBE-N细胞中mir-493-5p的表达水平是16HBE-T的0.28倍,在16HBE-T组过表达mir-493-5p后实验组细胞增殖能力下降。结论:mir-493-5p表达水平的改变对细胞的增殖能力有影响,在anti-BPDE恶性转化细胞中低表达的mir-493-5p可能发挥着类抑癌基因的作用。

高通量实时荧光定量RT-PCR方法验证FL细胞对苯并(a)芘7,8-二氢二醇9,10-环氧化物处理的差异表达基因

目的验证由寡核苷酸微阵列检出的FL细胞对苯并(a)芘7,8-二氢二醇9,10-环氧化物(BPDE)处理的差异表达基因。方法FL细胞分别经0.1%二甲亚砜(DMSO)和0.5μmol.L-1BPDE处理,以高通量实时荧光定量RT-PCR方法(TaqMan(低密度芯片)平行检测185个目标基因的相对表达水平。结果BPDE处理组相对DMSO对照组,51个基因表达有差异,12个基因表达上调,39个基因表达下调,(n=3,P<0.05),涉及细胞增殖,分化,凋亡调控基因,转录调节基因和代谢酶基因等。结论高通量实时荧光定量RT-PCR可迅速对微阵列数据进行验证,差异表达谱有助于研究BPDE的毒理机制和细胞的应答反应。

硫化镍与苯并芘转化人支气管上皮细胞基因差异表达谱的研究

目的 用cDNA微阵列技术探讨经硫化镍 (NiS)与二羟环氧苯并芘 (dihydroxyepoxybenzopyrene ,BPDE)转化后的人支气管上皮细胞 ( 16HBE)基因的差异表达 ;以了解不同种类和性质的化合物在转化细胞及致癌分子机制方面的异同 ;为预防人类生存环境不同外来化合物对人类健康的危害和影响提供科学依据。方法 取 16HBE分为NiS处理组 ,BPDE处理组和 16HBE(对照组 )三组同步培养 ,传代至第 3 5代 ;提取三种细胞的总RNA ,逆转录合成cDNA并以Cy3 dCTP和Cy5 dCTP荧光素分别标记制作探针。探针混合后与含 40 0 0个人类基因的芯片杂交。以ScanArray 40 0 0扫描仪扫描芯片 ,以GenPixPro 3 0软件分析荧光信号 ,对三组差异表达的基因进行生物学信息分析。结果 NiS转化的 16HBE细胞与BPDE转化的 16HBE细胞经分析比较 ,呈现差异表达的基因有 2 2个 ,其中 11个 ( 5 0 % )下调 ,另 11个 ( 5 0 % )上调。结论 NiS与BPDE对 16HBE细胞株的转化作用在抑癌基因 ,细胞周期蛋白相关基因 ,细胞凋亡和应激反应基因相关基因 ,DNA合成、修复和重组蛋白相关基因 ,DNA结合、转录和转录因子类基因 ,细胞受体相关基因 ,代谢相关基因 ,蛋白翻译和合成相关基因等多类基因上呈现差异表达。

苯并芘代谢产物BPDE的细胞毒性研究及五味子乙素在预防HTR-8/SVneo细胞损伤中的作用

目的:探讨苯并芘[Benzo(a)pyrene,BaP]代谢产物二氢二醇环氧苯并芘[7,8 dihydrodiol 9,10epoxidebenzo(a)pyrene,BPDE]对人绒毛膜外滋养细胞株HTR-8/SVneo的毒性效应及五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)对BPDE诱导的HTR8/SVneo细胞损伤的保护作用。方法:以HTR-8/SVneo细胞为载体,构建BPDE对HTR-8/SVneo细胞的染毒模型和Sch B对HTR-8/SVneo细胞的保护模型,利用MTS细胞增殖实验检测不同浓度的BPDE单独给药和Sch B联合BPDE给药对HTR-8/SVneo细胞增殖的影响。结果:5μmol/L BPDE即可使细胞活力显著下降,活细胞数仅占总细胞数的38.23%。经不同浓度的Sch B(0.625、1.25、2.5、5、10和20μmol/L)预处理后再以BPDE干预,细胞活力较前明显上升,分别为40.11%、42.68%、46.47%、47.34%、61.37%和49.87%,其保护作用在0.625~10μmol/L之间呈浓度依赖关系。结论:BPDE对HTR-8/SVneo细胞产生剂量依赖的毒性效应;Sch B(0.625~10μmol/L)对BPDE诱导的细胞损伤有保护作用。