定点突变提高虎杖聚酮合酶的苯亚甲基丙酮合酶活性

虎杖(Polygonum cuspidatum)聚酮合酶(polyketide synthase 1,PcPKS1)同时具有查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)及苯亚甲基丙酮合酶(benzylidene acetone synthase,BAS)催化活性,能够催化生成聚酮类化合物柚皮素查尔酮和苯亚甲基丙酮,进而催化合成黄酮类或覆盆子酮等具有多种生物学活性的化合物。本研究通过分析虎杖PcPKS1与掌叶大黄(Rheum palmatum)BAS、拟南芥(Arabidopsis thaliana)CHS等家族成员的序列以及酶催化位点的构象,确定可能影响酶功能的3个氨基酸位点:Thr133、Ser134、Ser339。采用定点突变对PcPKS1进行分子修饰,成功获得2个突变体并进行相关体外酶促反应,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)产物分析结果表明,在pH 7.0和pH 9.0的体外酶促条件下,突变体T133LS134A和S339V维持BAS和CHS双功能活性,且BAS活性显著高于原PcPKS1。本研究为利用PcPKS1进行基因工程调节黄酮类和覆盆子酮化合物的生物合成提供理论依据。

虎杖苯亚甲基丙酮合酶PcPKS2的表达纯化和晶体生长

植物类型Ⅲ聚酮合酶超家族(PKSs),又称查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)超家族,催化合成多种植物次生代谢产物的分子骨架。苯亚甲基丙酮合酶(Benzalacetone synthase,BAS)催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A通过一步脱羧缩合反应生成苯亚甲基丙酮,是一系列具有重要生物学活性苯丁烷类化合物及其衍生物的前体化合物。前期工作从虎杖中分离出苯亚甲基丙酮合酶BAS(PcPKS2)和1个具有CHS和BAS活性的双功能酶(PcPKS1)。两者与超家族其他成员序列经比较,在包括门卫氨基酸Phe215和Phe265在内的重要氨基酸序列存在一定差异。已有蛋白晶体学研究结果表明,PKSs家族不同成员的功能多样性来自于酶催化位点的非常微小的构象变化。为了能够从结构上比较PcPKS2和Pc PKS1双功能酶活性差异可能产生的机制,以确定其高效BAS活性的分子机理,研究利用了大肠杆菌原核表达系统过量表达了C-端融合有His6标签的重组蛋白,经纯化得到了高纯度蛋白。经过对其晶体生长条件进行摸索和优化,得到了能用于X-射线衍射的单晶,为其结构解析、催化机理研究、了解虎杖聚酮类化合物生物合成机制和该类酶在基因工程中的应用提供了基础。