苯胺双加氧酶基因的克隆与序列分析

通过设计苯胺双加氧酶基因特异引物,以苯胺降解菌株ANA5基因组DNA为模板,PCR扩增出目的基因片断。然后利用粘粒pLAFR3作为载体,以E.coliEPI100作为受体,构建了菌株ANA5的基因组粘粒文库。以PCR扩增产物作为探针,通过菌落原位杂交筛选得到两个阳性克隆,经Southern杂交及亚克隆测序分析,初步确认克隆到苯胺双加氧酶基因。同时完成了苯胺双加氧酶基因atdA3A4A5序列的测定,并对其核苷酸及其推导的氨基酸序列进行分析,结果表明克隆到的苯胺双加氧酶基因与GenBank报道的基因有一定的差异,同时体现了该基因在进化上的保守性。

产邻苯二酚工程菌的构建及发酵条件的优化

从实验室保存的一株能高效降解苯胺的不动杆菌中克隆到完整的苯胺双加氧酶基因簇,序列分析表明该基因簇包含6个完整的ORF,全序列与已报道的不动杆菌YAA的苯胺双加氧酶基因簇在氨基酸水平上有较高的同源性。将该基因簇连接于pLAFR6载体,电转化至E.coli,构建了该基因簇的工程菌。发酵条件优化表明,在苯胺浓度0.5mg/ml,采用pH7.0的LB培养基,E.coliDH5α为宿主菌,于37℃培养,接种量为3%的条件下,邻苯二酚产量在20h达到0.546mg/ml,底物分子水平转化率可达92.4%。