圈卷产色链霉菌分化及其特性的研究

链霉菌分化的分子生物学研究是一个饶有兴趣并富有挑战性的世界前沿研究课题.在原核生物的分化研究中,主要以枯草杆菌(Bacillus subtilis)作为模式系统,但枯草杆菌的生命周期尤其是分化过程远比链霉菌简单,不象链霉菌有基质菌丝、气生菌丝、菌丝螺旋和孢子分隔那样的发育分化过程[1].在真核生物中也有分化研究的报道,如构巢曲霉、酵母等.由于真核生物的基因结构比原核生物复杂得多,弄清分化中基因调控的关系就更加困难.因此,选用链霉菌作分化研究的材料有其独一无二的优越性.国际上有关链霉菌的分子生物学研究,近年来主要以链霉菌的抗生素生物合成基因和链霉菌的分化基因两个大的方面作为研究的热点和主攻方向,并展开了一些开拓性的研究.

淀粉酶产色链霉菌TUST2中ε-聚赖氨酸降解酶的纯化和性质

分离得到产抗菌聚氨基酸ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌TUST2,从中纯化了ε-聚赖氨酸降解酶,并对其性质进行了研究.结果表明,该酶为膜结合蛋白.为提取该降解酶,先收集菌体细胞并用超声波破碎,细胞膜部分用1.0mol/LNaSCN溶液溶解.将粗酶液进行SephadexG100凝胶柱层析分离.用100mmol/L磷酸缓冲液洗脱,收集活性部分.纯化后的样品用SDS-PAGE检测,酶亚基分子量约为54700.酶活力在pH=6.0～9.0间稳定,最适宜pH=7.0.酶的最适温度为30℃,在10～50℃水浴30min酶活力未见明显下降.研究了不同金属离子对酶活力的影响,结果表明,Zn2+,Cu2+和Fe3+可分别提高酶活力29.72%,15.85%和15.08%;但Ag+,Hg2+,Co2+和Mn2+对酶活力有强烈的抑制作用.Ca2+,K+和Ba2+对酶活力没有影响.添加4%Tween-80能提高酶活力10%,但EDTA能强烈抑制酶活力.研究结果表明,此降解酶的性质与白色链霉菌产生的ε-聚赖氨酸降解酶的性质相似.

常压室温等离子体诱变绿色产色链霉菌及阿维拉霉素高产菌选育

目的筛选获得阿维拉霉素高产菌株。方法对一株绿色产色链霉菌实施常压室温等离子体诱变,以中间产物类似物氨基丁酸和高浓度的Ca Cl_2为筛选因子,结合统计学分析,通过琼脂块移接法初筛和管碟法复筛。结果获得一株高产阿维拉霉素的绿色产色链霉菌D60-9-20,经摇瓶发酵后,HPLC检测发酵液中阿维拉霉素产量达到545mg/L,较出发菌株产量提高了232%,并具有稳定的遗传性能。结论常压室温等离子体诱变能有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,得到的绿色产色链霉菌菌株D60-9-20具有生产阿维拉霉素的潜在应用价值。

色褐链霉菌磷脂酶D基因pld的克隆与表达

利用表达载体pET-22b(+),实现了色褐链霉菌磷脂酶D基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达。利用镍亲和柱对表达产物进行纯化,将纯化后的重组磷脂酶D作用于底物卵磷脂和丝氨酸定向合成磷脂酰丝氨酸,并用HPLC法检测酶活力。结果表明,目的蛋白可在短时间内进行大量表达。转酯反应6 h后卵磷脂的转化率达到31%,重组磷脂酶D活力达到39 U.(mg蛋白)-1。

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因——sanH和sanI的研究

通过反向遗传学方法克隆到圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因簇中约 7 0kb的DNA片段。该片段除含有尼可霉素生物合成基因sanF外 ,对sanF上游约 2 2kb的BglⅡDNA片段进行序列测定及分析表明 ,还含有两个完整的开放阅读框 (ORF)。ORF1由 1 2 33个核苷酸组成 ,ORF2由 1 95个核苷酸组成 ,它们分别编码由 41 0个氨基酸残基和 64个氨基酸残基组成的蛋白质 ,依次命名为sanH和sanI。蛋白序列数据库比较结果表明 ,SanH和SanI与浅灰链霉菌 (Streptomycesgriseolus)中共转录的细胞色素P450 (cytochromeP450 )和铁氧还蛋白 (ferredoxin)有较高的同源性 ,一致性分别为 46%和 56% ,相似性分别为 62 %和70 %。基因功能研究表明 ,sanH基因的破坏虽不影响圈卷产色链霉菌产生的尼可霉素的生物活性 ,但该基因可能参与了尼可霉素羟基化反应的生物合成。

色褐链霉菌产磷脂酶D的发酵条件研究

采用单因素试验,对色褐链霉菌产磷脂酶D(PLD)的发酵培养条件和培养基组成进行了优化。结果表明,色褐链霉菌摇瓶发酵最佳条件为:发酵周期7 d,发酵温度28℃,发酵培养基初始pH 6.0,接种量3%,发酵培养基装液量10 mL(100 mL三角瓶),摇床转速200 r/min;培养基最佳组成为:蛋白胨20.0 g/L,可溶性淀粉25.0 g/L,MgSO4.7H2O 0.5 g/L,CaCO3 1.0 g/L,Tween 8020.0 g/L。

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因—sanL的结构与功能

利用染色体步移策略 ,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针 ,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约 1 0kb的DNA片段。序列分析表明此片段中除含有sanK外 ,在sanK的上游还有一个完整开放阅读框———sanL。sanL与sanK的转录方向相同 ,具有 1 2 81个核苷酸 ,起始密码子为 345位的ATG ,终止密码子为 1 62 3位的TGA。利用Blastx程序进行的分析揭示 ,此基因可能编码一个赖氨酸 2 氨基转移酶。基因功能研究表明 ,该基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成所必需的。

产色链霉菌SY20-2与龟裂链霉菌SY20-4的种间原生质体融合

利用卡那霉素（250 μg/mL）、链霉素（1 000 μg/mL）和罗红霉素（150 μg/mL）标记亲本菌株SY20-2、SY20-4,进行种间原生质体融合.试验结果表明,培养基中加入0.5%～1%甘氨酸可以提高菌丝体对溶菌酶的敏感度,有利于原生质体的释放.溶菌酶不仅影响原生质体的形成,而且影响原生质体的再生率,因此在35℃水浴条件下,SY20-2选择酶浓度2 mg/mL,作用时间30 min;SY20-4选择酶浓度4 mg/mL,作用时间40 min,最适于原生质体的再生.以45%PEG（分子量1 000）作助融剂,融合频率为0.124%,选出153个融合子,其中3株重组子的稳定性及抑菌活性较好,重组子C对烟草野火病菌的抑菌活性比对照要好.

甘氨酸对淀粉酶产色链霉菌Cbγ4产ε-聚赖氨酸的影响

为了研究甘氨酸对淀粉酶产色链霉菌Cbγ4产ε-聚赖氨酸的影响,在种子培养阶段添加不同浓度的甘氨酸。结果表明,在种子培养初期添加3 g/L甘氨酸,天冬氨酸激酶活性会明显提高,ε-聚赖氨酸最高可积累0.51g/L,比对照组高27.5%。5L自控式发酵罐发酵ε-聚赖氨酸试验中,种子液中添加甘氨酸组比对照组明显提高了菌体耗糖速度,缩短了达到最高生物量的积累时间,ε-聚赖氨酸产量也提高至12.87g/L,糖酸转化率也比对照组提高了30.6%。因此甘氨酸可作为一种新型营养物质用于ε-聚赖氨酸的生产。

淀粉酶产色链霉菌1628中toyF基因的克隆与丰加霉素合成相关性

为考察编码腺苷琥珀酸裂解酶toyF基因对淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628合成丰加霉素的影响,本研究设计简并引物,首次克隆获得了菌株1628的toyF基因,并构建了敲除质粒p KC1132-toyF’,通过接合转移转入菌株1628,获得toyF基因缺失株1628-ΔTOYF。结果表明,与原始菌株1628相比,缺失株1628-ΔTOYF中TOYF的酶活和丰加霉素产量分别降低66.7%、87.5%。在缺失株1628-ΔTOYF中回补表达toyF基因构建了重组菌1628-ΔTOYF/toyF。重组菌1628-ΔTOYF/toyF中的TOYF酶活和丰加霉素产量,较缺失株1628-ΔTOYF分别提高了2.7和8.3倍。由此可见,toyF基因是参与菌株1628生物合成丰加霉素的关键酶基因。本文toyF基因的克隆及其功能研究,为克隆完整的丰加霉素生物合成基因簇及其丰加霉素生物合成机制的研究奠定了基础。

淀粉酶产色链霉菌1628发酵培养基及发酵条件的优化

淀粉酶产色链霉菌1628(Streptomyces diastatochromogenes)是一株具有广阔应用前景的生防菌株,其合成的主要活性物质为核苷类抗生素——丰加霉素.为了提高淀粉酶产色链霉菌的发酵水平,本研究采用单因素和正交实验设计,对菌株1628的发酵培养基和发酵条件进行了优化,优化后的最佳培养基配方为:可溶性淀粉1.5%、黄豆粉5%、FeSO40.1%、CaCO30.5%、NH4NO3 0.3%、KH2PO4 0.3%,最适初始pH7.0.在供试的发酵条件内,装液量60mL/250mL,发酵温度28℃,摇床转速180r/min,发酵时间为92h.活性物质丰加霉素的产量最高156.17mg·L-1,比优化前提高了3.3倍.

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因──sanJ的克隆及功能研究

以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针，从圈卷产色链霉菌cosmid基因文库中筛选到1个大约7.5kb的DNA片 段，将此DNA片段克隆到载体pBluescripM13-的Kpn I位点，得到了重组质粒pNL2200。对pNL2200中外源DNA片段进行了一系列的亚克隆及部分核苷酸序列分析，结果表明，2.3kb的Sal I-BamH DNA片段中含有1个完整的开放阅读框，起始密码子为271位的GTG，终止密码子为1954位的TGA，该基因的大小为1 686bp，编码1个大小为561个氨基酸的蛋白质产物。利用blastx程序在蛋白质数据库中进行同源比较，结果揭示此基因产物与腺苷酸形成酶超家族的连接酶有44%的一致性。此外，该基因的破坏导致圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成能力的丧失，证明它是尼可霉素生物合成所必需的，命名其为sanJ。

复合诱变选育绿色产色链霉菌抑菌高活性菌株

以一株绿色产色链霉菌xzte06菌株为出发菌株,依次通过软X射线、低能离子束诱变、紫外线照射和微波诱变手段对菌株进行复合诱变,得到一株对产气荚膜梭状芽胞杆菌具有较强抑制活性的菌株W26菌株,且该菌株的遗传特性稳定。对菌株进行抑菌试验发现,该菌株液体深层发酵菌丝体的内酮提取物的抑菌活性与出发菌株相比提高了101.42%。

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因-sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略 ,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针 ,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约 10kb的DNA片段。对其中 1 8kb的PvuII SacII片段进行了序列分析 ,结果表明 :此片段中含有一个具有1170个核苷酸的完整开放阅读框 ,起始密码子为 44 7位的ATG ,终止密码子为 16 14位的TGA ,推测其编码一个389个氨基酸的蛋白质产物。利用BLASTX程序进行的分析揭示 ,此基因编码一个肌氨酸单体氧化酶。基因功能研究结果表明 ,此基因与圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成直接相关 ,命名为sanK。

菌丝体形态对淀粉酶产色链霉菌CGMCC3145发酵生产ε-聚赖氨酸的影响

采用淀粉酶产色链霉菌CGMCC3145发酵生产ε-聚赖氨酸(ε-PL),考察Mg2+和孢子浓度对菌丝体形态和ε-PL的影响。结果表明,Mg2+可以使菌丝体更好地分散,培养基中添加0.5 g/L Mg2+,ε-PL比对照组提高了30.91%;发酵初始时添加Mg2+对ε-PL的生物合成最有利。当接种1.0×105 cfu/mL孢子悬液时,菌丝球直径为1.0×108 cfu/mL的2.66倍。相反,ε-PL产量、生物量、菌丝球的体积和菌丝球个数/mL与孢子接种浓度呈正相关,当接种1.0×108 cfu/mL孢子悬液时,上述4个指标分别比接种1.0×105 cfu/mL时提高68.2%、58.8%、126.2%和114.9%。

产色链霉菌MY02原生质体制备条件的研究

菌株MY02为本实验室自蔬菜保护地土壤中分离获得的一株链霉菌菌株熏该菌株对多种植物病原菌的抑菌活性较好,菌株MY02在菌丝培养液中的对数生长期为50～55h。培养基中加入0.5%～1%的甘氨酸可以提高菌丝体对溶菌酶的敏感度,25%的蔗糖浓度即可保证形成一定量的菌丝,又可使菌丝的分散程度较好,有利于原生质体的释放;对数生长后期的菌丝体形成原生质体的速度与初期、静止期差别不显著。在35℃水浴条件下,菌株MY02最佳溶菌酶浓度为2mg·mL-1,形成每毫升超过107个原生质体的时间30min。

淀粉酶产色链霉菌杀灭钉螺研究

从钉螺孳生土壤中分离得一株放线菌(编号218),经鉴定为淀粉酶产色链霉菌。实验室用摇瓶培养物0.1％浸杀钉螺,48h校正死亡率为96.0％—100.0％;以工业生产菌粉10mg/L浸杀钉螺,48h校正死亡率达98.0％,100mg/L浸泡螺卵,48h孵出率为9.0％。现场用菌粉75mg/L浸泡48h,钉螺校正死亡率为96.9％,试验区植物无枯黄。对鱼类有一定的毒性,但作用缓慢。

圈卷产色链霉菌分化关键基因——saw1的克隆及酶切分析

链霉菌是现代生物学研究中一种重要的微生物,它有两个突出的特征:其一,有无与伦比的合成次生代谢产物的能力,世界上所知数千种抗生素的70％由其产生。其二,有一个复杂的发育分化的生命周期,是微生物分化研究的一个最好的模式材料。链霉菌分化主要为形态分化和生理分化,两者彼此独立又相互关联,构成复杂的分化调控网络,研究分化基因的调控不但有重要的理论意义,而且可用于控制抗生素的生物合成,因此弄清合成途径的分子机制,也有潜在的应用价值。

圈卷产色链霉菌分化相关基因——saw1的结构和功能

用双脱氧链终止法进行了分化基因——saw1的双链测序.结果表明在1500bp的DNA片段中有一个完整的开读框架(ORF),其编码区是在419bp至1252bp处.其产物与已知的天蓝色链霉菌whiG的氨基酸序列有89%的同源性.当把1500bp的saw1DNA片段插入到链霉菌表达质粒载体pIJ702后,构建的重组质粒转化天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71,可使C71形成孢子和灰色色素.用基因破坏的策略进一步研究了该基因的生物学功能,结果表明saw1在圈卷产色链霉菌气生菌丝到孢子形成的发育转变中有重要作用,是分化中控制孢子发育起始的一个重要基因.

醇类物质对淀粉酶产色链霉菌Bcα1产ε-聚-L-赖氨酸聚合度的影响

为了在不影响ε-聚-L-赖氨酸（ε-Poly—L—Lysine，ε—PL）抑菌性能的同时减弱其带有的苦味，改善口感，研究了向培养基中添加不同醇类物质对淀粉酶产色链霉菌Bcα1产ε-PL聚合度分布的影响，并且比较了分别以葡萄糖和甘油为碳源对Bcctl产ε-PL聚合度的影响。结果表明：向以葡萄糖为碳源的培养基中添加0．5％的正丁醇后，ε-PL平均聚合度明显降低由31～32降低至24～25。进一步分析推测，正丁醇的羟基能够与ε-PL末端羧基结合，发生酯化反应，所得ε—PL衍生物为ε—PL酯，且该反应的发生有利于ε—PL链长延伸的终止。