伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)2-萘酸单加氧酶基因(nmo)的克隆及表达

通过酶切连接将Burkholderiasp.JT1 5 0 0的一段DNA片段 (4 8kb)亚克隆到表达载体pUC1 8上 ,得到重组子pEK1 2 3。测序后的pEK1 2 3重组子 4 8kb插入片段的序列已经登陆欧洲EMBL基因库 ,序列接受号为AJ5 663 3 3。对这一DNA片段的序列分析显示 ,此DNA片段含有 3个阅读框 ,且在这 3个阅读框 5′端发现一启动子特异序列。再用酶切连接方法得到仅含一个阅读框的重组子pXK3 ,其阅读框长度为 1 1 5 8bp ,编码 3 86个氨基酸 ,与已报道的RalstoniaeutrophaHF3 9羟化酶 (单加氧酶 ,bec)氨基酸序列有 64%的同源性。pEK1 2 3对 2 萘酸代谢途径中 4个关键底物的转化实验结果显示 ,其基因产物仅对 2 萘酸发生加氧转化反应 ,而且 2 萘酸浓度有明显的降低 ,证实此基因是 2 萘酸单加氧酶基因 (nmo)。同时发现其基因产物也可以转化苯甲酸钠。该酶对苯甲酸的加氧转化途径正在研究中SDS PAGE结果表明 ,pXK3、pEK1 2 3两重组子中 2 萘酸单加氧酶表达量并没明显区别 ,但加氧酶酶活却存在显著的差别。推测在启动子后 ,单加氧酶阅读框前的两个阅读框的基因产物 ,对单加氧酶活有促进作用。

基因工程菌漆酶降解2-氯苯酚的研究

利用基因工程菌甲醇毕赤酵母(PMAD16/pMET(A-Lcc1)培养产生的重组漆酶,研究了重组漆酶对降解2-氯苯酚的影响。结果表明:重组漆酶对2-氯苯酚降解的最佳pH值为6.0,温度为50℃,当溶液中漆酶活力为1.2 U/mL时,在最适脱色条件下作用6 h,粗漆酶和纯化漆酶对2-氯苯酚(250 mg/L)的降解率分别为91.3%和88.2%,重组漆酶可有效地降解2-氯苯酚。

红球菌35R1中邻苯二酚1,2-双加氧酶的表达及纯化

3,5-二甲基苯酚(3,5-DMP)是一种重要的精细化工原料以及有机合成中间体,在工农业生产领域广泛应用并大量排放到环境中,对人类和环境造成了巨大的危害。Rhodococcus sp.35R1是一株以3,5-二甲基苯酚为唯一碳源和能源的高效降解菌。为验证菌株35R1中3,5-二甲基苯酚是通过邻苯二酚途径开环代谢的,通过生物信息学分析,寻找到35R1基因组上的邻苯二酚1,2-双加氧酶编码基因catA,通过一步克隆法将其连接到表达载体pET28a(+)上,然后,将其转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中,从而进行该基因的异源表达。结果成功在35R1基因组上扩增到catA基因,构建了重组质粒pET28a-catA,采用自诱导的方法诱导表达了邻苯二酚1,2-双加氧酶,纯化酶可催化邻苯二酚生成顺式粘糠酸。

水稻纹枯病菌RsPhm基因的克隆及其表达分析

【目的】为了阐明苯酚2-单加氧酶基因(Rs Phm)在水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)黑化中的功能,【方法】采用常规PCR和RT-PCR技术对该基因进行克隆和生物信息学分析,通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测在儿茶酚胁迫下该基因的相对表达量。【结果】生物信息学分析结果表明,Rs Phm基因的DNA和c DNA全长序列分别为2 628 bp和1 983 bp,编码660个氨基酸。系统进化树分析显示,Rs Phm基因在立枯丝核菌(R.solani)不同融合群中具有较近的亲缘关系,在不同真菌之间在进化上具有一定保守性。通过q RT-PCR技术分析了在不同浓度儿茶酚胁迫下水稻纹枯病菌Rs Phm基因的转录表达情况。外源儿茶酚能提高Rs Phm基因的表达量,在12.5μg/m L浓度下表达量最高,极显著上调35.7倍,在25μg/m L和50μg/m L浓度下表达量分别上调19.1倍和28.4倍,但在100μg/m L浓度下表达量仅上调2.1倍。【结论】获得了Rs Phm基因全长序列,了解了其基本生物学信息,明确了其在儿茶酚胁迫下的表达模式。研究结果为科学、系统地阐明水稻纹枯病菌Rs Phm基因调控黑色素形成机制奠定了理论基础。

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007吲哚-3-乙酰胺IAA合成功能及其依赖途径鉴定

【目的】探索吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)合成生长素吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)的能力,并阐明B.pyrrocinia JK-SH007存在色氨酸依赖型的吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide, IAM)IAA合成途径。【方法】使用Salkowski比色法和酶联免疫吸附法(ELISA)进行L-色氨酸对B.pyrrocinia JK-SH007合成IAA能力影响的检测;以B.pyrrocinia JK-SH007全基因组为模板,设计特异性引物克隆iaaM和iaaH基因,并使用生物信息学方法对其蛋白质和亲缘关系进行分析;通过实时荧光定量PCR方法分析B.pyrrocinia JK-SH007中的iaaM和iaaH基因在L-色氨酸处理下的差异表达。【结果】B.pyrrocinia JK-SH007菌株能够合成15.663μg·mL-1的IAA,在以L-色氨酸为前体的条件下其合成IAA的量显著增加,达到了44.404μg·mL-1。iaaM和iaaH基因均含有一个完整的开放阅读框,其中iaaM基因全长1 782 bp,编码593个氨基酸,属于Aminooxidase super family家族;iaaH基因全长1 368 bp,编码455个氨基酸,属于Amidase super family家族。在L-色氨酸的处理下,B.pyrrocinia JK-SH007中的iaaM和iaaH基因的表达量均显著增加。【结论】B.pyrrocinia JK-SH007具有合成IAA的能力,L-色氨酸对其合成IAA具有显著促进作用,且克隆得到了iaaM和iaaH基因,其在进化上具有一定的保守性,证明B.pyrrocinia JK-SH007中存在吲哚-3-乙酰胺IAA合成途径。

中国人肝脏细胞色素P4502E1表达──基因型与表型的关系

细胞色素Ｐ４５０（ＣＹＰ）２Ｅ１代谢激活多种致癌物并参与酒精代谢和自由基形成，其基因启动子区ＲｓａＩ单核苷酸多态与酒精性肝病和某些癌症如食管癌和肺癌的易感性相关．以免疫印迹和特异底物的方法研究了ＲｓａＩ识别的不同基因型肝脏标本中ＣＹＰ２Ｅ１蛋白含量及其功能活性的差异．结果表明，ｃｌ／ｃ１基因型（ｎ＝２８）的蛋白含量（（１２４．０± ８３．９）ｐｍｏｌ／ｍｇ）高于携带至少一个ｃ２等位基因的变异基因型（（６５．５±３８．９）ｐｍｏｌ／ｍｇ， ｎ＝ ２２），差异有极显著性（Ｐ＜ ０．０１）．ｃｌ／ｃ１基因型的肝微粒体代谢４－硝基苯酚的活性也同样显著高于变异基因型（（１９８．４±２７．８）ｐｍｏｌ／（ｍｉｎ· ｍｇ）比（１０１．２± １８．１）ｐｍｏｌ／（ｍｉｎ·ｍｇ）， Ｐ＜０．０１））．结果证明，ＣＹＰ２Ｅ１表达水平和酶活性的个体差异与ＲｓａＩ识的基因多态有关，这与分子流行病学研究发现的ｃ１／ｃ１基因型是某些癌症的遗传易感因素一致．