3-甲基腺苷对芹菜素诱导乳腺癌T47D细胞系自噬和凋亡的影响

目的:研究自噬抑制剂3-甲基腺苷(3-methylaclenine,3-MA)对芹菜素诱导乳腺癌T47D细胞系自噬和凋亡的影响。方法:常规培养人乳腺癌T47D细胞,分为对照组、3-MA组、芹菜素组、3-MA+芹菜素组。MTT法检测各组的细胞增殖抑制率;GFP-LC3质粒转染观察各组细胞自噬情况;Hochest/Mito-Red/YO-PRO-1染色法观察各组细胞凋亡形态;Annexinv/PI双染法流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;western hlot法检测LC3及PARP的变化。结果:MTT示3-MA+芹菜素组的增殖抑制率明显高于其他各组(P<0.05);GFP-LC3质粒转染结果显示:对照组,3-MA组及3-MA+芹菜素组自噬不明显,而芹菜素组与其他各组相比自噬明显增多(P<0.05);3-MA+芹菜素组的凋亡细胞增多,各组凋亡率分别为(12.73±0.05)%,(18.46±0.03)%,(23.27±0.07)%,(34.14±0.05)%,与对照组相比有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,芹菜素组LC3-Ⅱ增高,而3-MA组及3-MA+芹菜素组的LC3-Ⅱ显著减少,3-MA+芹菜素组PARP的剪切带相比其他各组明显增加。结论:自噬抑制剂3-MA抑制细胞自噬后,能够明显增强芹菜素对乳腺癌T47D细胞系的凋亡诱导效应。

METTL3在同型半胱氨酸诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用

背景:高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血症与胰岛β细胞功能密切相关,但其具体分子机制尚不完全明确。目的:探讨METTL3在Hcy诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用。方法:取第3,4代小鼠胰岛β细胞进行实验。①细胞模型建立和分组:对照组细胞不加入Hcy,Hcy组细胞加入浓度为100µmol/L Hcy干预48h;②按Lipofectamine^(TM) 2000说明书将过表达质粒Ad-METTL3及si-METTL3转染小鼠胰岛β细胞,设计3种不同干扰片段,PCR验证、筛选出干扰效率最好的干扰片段;③转染后实验分组:对照组、Hcy组、Ad-NC(阴性对照)+Hcy组、Ad-METTL3+Hcy组、si-NC(阴性对照)+Hcy组和si-METTL3+Hcy组;④采用qRT-PCR及Western blot检测细胞中METTL3及细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62的表达;ELISA法测定胰岛素水平来评价胰岛β细胞胰岛素分泌能力;分别过表达和干扰METTL3后检测细胞自噬相关蛋白及胰岛素水平。结果与结论:①与对照组相比,Hcy组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平升高(P<0.05),而p62表达明显降低(P<0.05),胰岛素分泌能力明显下降(P<0.05);②与对照组相比,Hcy组中METTL3蛋白及mRNA水平表达均降低(P<0.05);③胰岛β细胞中沉默METTL3后,Hcy进一步上调了细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ的表达(P<0.05),而p62表达显著下降(P<0.05),细胞中胰岛素水平增加(P<0.05);过表达METTL3后,Hcy则使LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著降低且p62表达则增高(P<0.05);④结论:METTL3参与了Hcy诱导的胰岛β细胞自噬调控,对胰岛素的分泌发挥着调控作用。

N6-甲基腺苷甲基化转移酶3对动脉粥样硬化的影响及其作用机制

目的:探讨N6-甲基腺苷甲基化转移酶3(METTL3)调节动脉粥样硬化的作用及其分子机制。方法:人THP-1单核细胞采用100 ng/ml PMA和75μg/ml Ac-LDL诱导贴壁,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质免疫印迹分析METTL3和肝癌衍生生长因子(HDGF)mRNA和蛋白质表达水平。采用短发卡RNA(shRNA)敲低和过表达METTL3,分析肝癌衍生生长因子(HDGF)mRNA和蛋白质表达水平;生物信息学分析mRNA上m6A修饰情况;Dil-Ac-LDL荧光探针分析巨噬细胞脂滴摄取能力。高脂喂养的ApoE-/-小鼠分为METTL3/对照组和METTL3/HDGF敲低组,采用油红O染色分析主动脉脂质堆积情况,采用苏木精-伊红(HE)染色分析动脉粥样硬化斑块面积。组间计量数据比较采用独立样本t检验。结果:THP-1巨噬细胞经75μg/ml Ac-LDL处理后,对照组细胞METTL3和HDGF mRNA和蛋白质(1.03±0.09、0.60±0.09;1.00±0.08、0.76±0.13)明显低于泡沫化组(1.68±0.11、1.01±0.11;1.58±0.11、1.19±0.08),差异有统计学意义(t=12.920、8.263、12.470、7.746,P<0.05)。对照组巨噬细胞HDGF mRNA和蛋白质(1.72±0.14、1.18±0.08)明显高于METTL3 KD组(1.01±0.10、0.72±0.15),差异有统计学意义(t=11.850、7.875,P<0.05)。对照组巨噬细胞胆固醇提呈率(0.48±0.06)明显高于METTL3 KD组(0.24±0.04),差异有统计学意义(t=9.155,P<0.05)。对照组巨噬细胞胆固醇提呈率[(329.08±23.15)mg/ml]明显高于METTL3 KD组[(236.08±21.53)mg/ml],差异有统计学意义(t=8.319,P<0.05)。对照组巨噬细胞HDGF mRNA m6A水平(1.00±0.09)明显高于METTL3 KD组(0.53±0.12),差异有统计学意义(t=8.799,P<0.05)。METTL3/对照组小鼠总动脂质沉积比和主动脉斑块面积比[(35.52±5.87)%、0.65±0.06]明显高于METTL3/HDGF敲低组[(22.96±3.43)%、0.29±0.05],差异有统计学意义(t=5.227、12.090,P<0.05)。结论:m6A甲基化酶METTL3通过RNA甲基化上调HDGF表达,促进巨噬细胞脂质大量堆积,加剧动脉粥样硬化的进展。

调节自噬提高人肝癌Bel-7402/FU细胞株对5-氟尿嘧啶的敏感性

目的:探讨细胞自噬对肝癌Bel-7402/FU细胞5-氟尿嘧啶敏感性的影响。方法:选取Bel-7402、Bel-7402/FU细胞株,分为对照组、5-氟尿嘧啶组、自噬抑制剂3-甲基腺苷组以及5-氟尿嘧啶+3-甲基腺苷组,MTT法了解抑制细胞自噬对肝癌5-氟尿嘧啶IC50值的影响;流式细胞术检测抑制细胞自噬对细胞凋亡的影响;GFP-LC3质粒转染观察细胞浆中GFP-LC3分布情况。结果:Bel-7402细胞株与Bel-7402/FU细胞株5-氟尿嘧啶IC50值分别为4.66、68.14μg/mL,凋亡率分别为13.80%、1.09%。3-甲基腺苷联合5-氟尿嘧啶作用后Bel-7402细胞株与Bel-7402/FU细胞株的氟尿嘧啶IC50值分别为4.31、29.44μg/mL,凋亡率分别为13.82%、6.86%。在3-甲基腺苷作用下,Bel-7402/5-FU细胞株5-氟尿嘧啶诱导的点状样GFP-LC3的细胞数量减少。结论:抑制细胞自噬可降低Bel-7402/FU对5-氟尿嘧啶IC50值,诱导细胞凋亡,从而有效地逆转Bel-7402/FU对5-氟尿嘧啶耐药。

N^6-苯甲酰基-2′-叔丁基二甲基硅氧基腺苷-3′-H-膦酸的合成工艺研究

目的研究N^6-苯甲酰基-2′-叔丁基二甲基硅氧基腺苷-3′-H-膦酸的合成工艺。方法以腺苷为起始原料,先对腺苷的嘌呤氨基进行苯甲酰基保护,再分别向腺苷的5′位和2′位引入二甲氧基三苯甲基(DMT)和叔丁基二甲基硅基(TBDMS)保护基,制备得到关键中间体N^6-苯甲酰基-5′-二甲氧基三苯甲氧基-2′-叔丁基二甲基硅氧基腺苷(3)。中间体3与磷试剂2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮反应引入膦酸基团,最后使用二氯乙酸脱除DMT保护基得到目标产物。结果经过5步反应得到了目标化合物N^6-苯甲酰基-2′-叔丁基二甲基硅氧基腺苷-3′-H-膦酸,并利用~1H-NMR、^(31)P-NMR、质谱等方法确证了其结构。本合成工艺的总收率为35.7%,目标化合物的质量分数为98.5%。结论该合成工艺与原有方法相比步骤短,操作简单,具有良好的应用前景。

白苞裸蒴的化学成分

目的 :研究白苞裸蒴的化学成分。方法 :硅胶柱色谱等方法分离 ,薄层色谱和波谱分析鉴定结构。结果 :从其全草的甲醇提取物中分离得到 3个化合物 ,分别鉴定为山奈酚 4′,7 二甲基 3 O 葡萄糖苷 ,胡萝卜苷和豆甾醇。结论 :均为首次从裸蒴属植物中分离得到。

抗坏血酸碳点通过促进自噬杀伤舌鳞癌细胞

目的:研究抗坏血酸碳点(ascorbic acid carbon dots,AACDs)对舌鳞癌细胞系Cal27的杀伤作用及其机制,为碳点在舌鳞癌治疗的应用奠定基础。方法:以Cal27为空白对照组,AACDs组、3-甲基腺苷(3-MA)组及AACDs+3-MA组为实验组,运用MTT法检测细胞增殖活性,吖啶橙(AO)染色法观察细胞自噬情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:MTT结果显示,AACDs能够抑制Cal27的增殖活性,并呈明显的剂量依赖性;AO染色结果显示,AACDs可以促进Cal27发生自噬,其中100 mg/L AACDs引发的自噬水平最高;加入3-MA降低AACDs引发的自噬水平后,细胞增殖活性水平升高,同时细胞凋亡水平降低。结论:AACDs通过促进自噬对Cal27发挥杀伤作用。

三叶鬼针草的黄酮苷类成分研究

目的研究三叶鬼针草Bidens pilosa的黄酮苷类成分。方法采用硅胶柱、凝胶柱、中压制备、高速逆流等色谱技术分离和纯化,通过UV、IR、1D和2D NMR等谱学分析鉴定化合物的结构。结果从三叶鬼针草95%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取物中分离得到6个黄酮苷类化合物,分别鉴定为2(R/S)-异奥卡宁-(3′,4′-二甲醚)-7-O-β-D-葡萄糖苷(1a/1b)、槲皮素-3,4′-二甲醚-7-O-吡喃葡萄糖苷(2)、槲皮素-3,4′-二甲醚-7-O-芸香糖苷(3)、(Z)-6-O-(6′-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基)-6,7,3′,4′-四羟基橙酮(4)、海生菊苷(5)、奥卡宁-4-甲醚-3′-O-β-葡萄糖苷(6)。结论化合物1a/1b为新化合物,命名为鬼针草苷H。

一测多评法同时测定大黄药材中8个结合型蒽醌含量的系统研究

目的:建立分别以其中任何1个结合型蒽醌为内参物均可用于测定大黄药材中8个结合型蒽醌的一测多评法(QAMS法)。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为30℃,检测波长为280 nm。分别以芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷为内参物,采用多点校正法,建立另外7个待测成分与内参物的相对校正因子(RCFs),计算待测成分与内参物色谱峰的相对保留时间(RRTs)。采用RCFs计算分别以其中1个成分为内参物时28批大黄药材中另外7个待测成分的含量,以差异百分比(PD)为参数,与外标法(ESM)测定结果进行比较,验证QAMS的准确性。结果:分别以芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-3-羟甲基-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-葡萄糖苷为内参物时,另外7个待测成分与内参物的RCFs分别为1.435、0.624、1.206、0.849、1.718、0.563、0.549,0.697、0.435、0.841、0.592、1.197、0.392、0.383,1.603、2.3、1.932、1.36、2.753、0.897、0.88,0.83、1.191、0.518、0.704、1.425、0.464、0.455,1.178、1.691、0.736、1.421、2.024、0.663、0.647,0.582、0.835、0.363、0.702、0.494、0.328、0.32,1.788、2.566、1.117、2.157、1.518、3.072、0.982和1.822、2.616、1.137、2.197、1.547、3.13、1.025,RRTs分别为1.207、1.47、1.68、1.719、1.763、1.768、2.015,0.829、1.218、1.393、1.425、1.461、1.466、1.671,0.681、0.821、1.143、1.169、1.199、1.203、1.371,0.596、0.719、0.876、1.023、1.049、1.053、1.2,0.583、0.703、0.856、0.977、1.026、1.029、1.173,0.568、0.685、0.835、0.953、0.975、1.003、1.143,0.566、0.683、0.832、0.95、0.972、0.997、1.139和0.497、0.599、0.73、0.834、0.853、0.875、0.878。8个成分含量的QAMS法计算结果的均值与ESM法测定结果之间的PD均<3%。结论:所建立的QAMS法准确、可行,可在实际工作中只有任何1个对照品情况下同时测定大黄药材中8个结合型蒽醌的含量。