3种苹果病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立

苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)和苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)对果树的生长发育危害严重,而且复合侵染几率较高,为快速、灵敏和高效的检测3种病毒,本研究根据ASPV、ASGV和ApNMV基因组保守序列设计特异引物建立了3种病毒高灵敏度的实时荧光定量PCR检测体系(Real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)。结果表明:引物ASGV-qF/qR-1、ASPV-qF/R-2和ApNMV-qF/R-3有较高的特异性,最适宜的退火温度分别为60℃、58℃和58℃,ASGV、ASPV和ApNMV 3种病毒的RT-qPCR体系比常规RT-2 PCR检测体系灵敏度高100倍,最低检出限分别为82.6、1.49×10^(2)和13.3 copies/μL。检测体系的Ct值的变异系数均小于5%,组间的变异系数在5%以内。河北农业大学果园中经RT-PCR确定带毒的88棵苹果树RT-qPCR检出率为100%,表明建立的RT-qPCR方法的可靠性和稳定性高,适用于田间果树3种病毒的检测,为苹果病毒的准确诊断提供了技术支撑。

5种苹果病毒多重PCR检测体系的建立

苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)和苹果锈果类病毒(ASSVd)是影响我国苹果产业健康发展的重要病毒病害,建立快速、准确的检测方法是防控病毒病的基础。分别设计了ACLSV、ApNMV和ASSVd 3种病毒的检测引物ACL-F1/R1、ApN-F2/R2和ASS-F1/R1,片段的大小分别为1112、1025、213 bp。利用新设计和已报道的苹果病毒特异性引物,通过引物检测效果比较、组合筛选、用量优化及退火温度调试,建立了5种苹果病毒多重PCR检测体系。该检测体系的扩增片段大小分别为ACLSV1112 bp、ApNMV640 bp、ASGV449 bp、ASPV349 bp和ASSVd213 bp。利用多重PCR和单一PCR分别对50份田间苹果样品进行病毒检测,结果显示,各样品多重PCR检测与单一PCR检测结果一致,表明本研究建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、高效地检测单一或复合侵染的5种苹果病毒。

我国苹果病毒病的研究现状

我国从1978年开始对苹果病毒病进行系统研究,目前初步明确了我国苹果主产区主要病毒病的种类及特性,在病毒检测方面也取得了很大进展。介绍了我国苹果上主要病毒的特性,这些病毒包括苹果花叶病毒(ApMV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)、苹果绿皱果病毒(AgrCV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎痘病毒(ASPV)和苹果茎沟病毒(ASGV);阐述了这些苹果病毒病所采用的技术,包括指示植物、电子显微镜技术、血清学方法、分子生物学技术等。

烟台市苹果病毒病的发生与防治

调查了烟台苹果病毒病的发生状况,概述了烟台市主要苹果病毒病种类、症状、危害特点和传播途径,提出了苹果病毒病的防治措施。

陕西宝鸡苹果病毒病发生因素调查与防控试验

苹果病毒病防治,从理论上讲只有建园时选用无病毒苗木和挖除染病树两种办法,但在实际种植过程中染病严重的园区,全园挖除对果农来说难以实现。通过对宝鸡市苹果主产区的5 个县24 个村46 个苹果园进行调查,针对果树病毒病主要经人为嫁接、接穗、苗木、修剪、工具、根系交叉损伤、刺吸式害虫等途径传播的特征,找出果区内几种主要的发病因素;针对这些发病因素进行多次试验, 总结一套完整的立体防控措施。通过开展土施、灌根、涂干、叶喷、输液等5 项试验,筛选出适宜宝鸡市苹果病毒病防治的最佳药剂组合,并得出结论:苹果病毒病当年的防控效果输液优于灌根,灌根优于喷雾,若喷雾、灌根、输液、涂干同时进行效果最明显,能在较长时间内稳定和控制住病害的发生,使树体恢复健康。

样本采集及寄送条件对苹果病毒RT-PCR检测效果的影响

为了解决采样季节、采样部位及寄送条件不规范影响苹果病毒样本检测可靠性的问题,以携带苹果锈果类病毒(Apple skin scar viroid,ASSVd)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus,ACLSV)、苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的苹果植株为试材,采用RT-PCR检测技术,研究了在不同月份采集果树不同组织部位,带毒样本在不同温度下保存不同时间,比较RT-PCR检测效果,以期为规范苹果病毒检测样本的采集、保存与寄送方式提供依据。结果表明:10月采样进行ASSVd、ACLSV、ApMV、ASPV RT-PCR检测,与其它时期相比检出率相对较高,以冠层下部1年生枝皮顶梢为材料对4种病毒进行RT-PCR检测,与其它组织部位相比检出率相对较高。4月采样,进行ASGV RT-PCR检测,检出率相对较高,冠层上部1年生枝皮顶梢较其它组织部位检出率高。1年生枝皮样本在4、25℃保存对RT-PCR检测影响相对较小,保存1 d和3 d,3棵树5种病毒的检测结果均为阳性,4℃条件下保存5 d,除ApMV,其它4种病毒3棵树检测结果均为阳性,保存7 d及以上多数病毒在测试温度下(0、4、25、37℃)检测结果为阴性。

基于逆转录重组酶聚合酶扩增技术的苹果病毒新型快速检测方法

利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术(Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA),为苹果病毒的快速检测提供技术支持。以苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和苹果坏死花叶病毒(apple necrotic mosaic virus,ApNMV)为检测对象,通过特异性RPA引物设计以及反应条件优化,对检测方法的灵敏度、特异性进行评价,并与传统RT-PCR方法进行比较。结果表明,所设计的RPA引物特异性高,反应温度为37℃,反应时间为20 min,RT-RPA对4种苹果病毒的检测灵敏度为9.63×10^(1) copies,是普通RT-PCR的10^(2)~10^(3)倍。所建立的RT-RPA检测方法具有等温反应、检测速度快、灵敏度高等优点,可以用于快速检测苹果病毒病。

我国苹果病毒病的现状及其检测技术的研究进展

苹果病毒病害分布广泛,果树感染病毒病后会极大影响苹果的品质和产量,而且苹果树一旦感染病毒便会终生带病,很难根除.因此,苹果病毒病已成为了制约我国苹果产业健康持续发展的关键所在.本文全面介绍了我国苹果病毒的种类、分布、危害、传播途径与防治措施,并阐述了苹果病毒的各种检测技术,包括指示植物法、电镜法、血清学法、分子生物学技术和高通量测序技术等,以期为将来有效防治苹果病毒病提供理论依据.

甘肃省4种苹果病毒检测及其分子多样性分析

为明确甘肃省苹果产区苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)4种病毒发生和分布情况,以及主要病毒的遗传多样性,采用RT-PCR技术进行鉴定,并对主要病毒cp基因片段测序分析。结果表明:在甘肃省5个市(县)苹果产区随机采集的93份叶片中,ASGV平均检出率达87.1%,ASGV成为危害甘肃省苹果的优势种,各苹果产区ASSVd、ACLSV和PNRSV平均检出率分别为41.9%、10.7%和11.8%,天水和兰州市4种苹果病毒检出率均高于其他地区;所有检测样品以“ASGV+ASSVd”为主要复合侵染类型,检出率达37.6%;4条ASGV cp基因片段的系统发育分析显示,4个分离物被聚在同一亚组,来自天水的分离物A29与来自中国云南苹果的ML-1分离物(JN871586.1)聚在同一支,与其核酸序列同源性为99.2%,A39与A42聚为一支,两者与来自中国陕西苹果的YL06分离物(EU236258.1)核酸序列同源性为97.1%和96.9%,A80与A39和A42共聚为一簇。

苹果病毒检疫问题刍议

在我国,多年来由于对苹果病毒病害的危害性缺乏足够的认识,缺乏对苹果病毒可行的检测手段,一直没有对其实施检疫,致使苹果病毒病害不断传播蔓延,为害日趋加重,给我国苹果生产造成了极大损失。本文拟就苹果病毒病害检疫问题,提出几点粗浅看法,供讨论参考。

苹果坏死花叶病毒CP基因原核表达及其抗血清制备

苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断.

一步RT-PCR法检测苹果锈果类病毒和苹果凹果类病毒

由类病毒引起的苹果病害在中国苹果主产区普遍发生,严重制约苹果产业的健康发展。对采自不同地区的带有典型症状的弘前富士、南方脆及惠民短枝富士果实,进行苹果锈果类病毒(ASSVd)和凹果类病毒(ADFVd)检测,发现两种病毒能够共侵染。根据ASSVd和ADFVd保守序列设计通用引物,建立了能快速、同时检测两种类病毒的RT-PCR方法。

苹果茎沟病毒侵染对嘎拉苹果果实品质的影响

为了明确苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)侵染对苹果果实品质的影响,以单一接种ASGV的嘎拉苹果盆栽树为材料,测定果实单果重、纵横径、硬度、维生素C、可溶性固形物、糖酸组分、花色苷组分以及香气物质含量等。结果表明,与健康植株相比,感染ASGV植株的果实纵横径无明显变化,单果重、果实硬度、可溶性固形物含量和可溶性糖含量显著降低,有机酸含量增加,香气组分占比发生改变,果皮中4种花色苷的含量均显著降低。

通辽市塞外红苹果中3种苹果潜隐病毒的检测及变异分析

【目的】明确通辽地区塞外红苹果(Maluspumila‘Saiwaihong’)中苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎痘病毒(ASPV)和苹果茎沟病毒(ASGV)3种苹果潜隐病毒的普遍率和遗传多样性。【方法】从通辽市开鲁县8个乡镇随机采集了96份塞外红苹果枝条,采用RT-PCR法对样品进行3种苹果潜隐病毒检测。对检测为阳性的样品进行病毒基因克隆、测序,并进行序列一致性分析和系统发育分析。【结果】检测结果表明,被检测的塞外红苹果中3种苹果潜隐病毒均有不同程度的发生,并且存在2种或3种病毒的复合侵染。基于CP基因对病毒一致性和变异情况进行分析,结果表明,来源于塞外红苹果的29个ACLSV分离物的核苷酸序列一致性为78.1%~99.9%,与其他15个已知的ACLSV分离物的一致性为69.1%~93.6%;来源于塞外红苹果的12个ASPV分离物的核苷酸序列一致性为83.6%~99.7%,与其他15个已知的ASPV分离物的一致性为75.4%~91.5%;来源于塞外红苹果的21个ASGV分离物的核苷酸序列一致性为96.4%~100.0%,与其他已知的40个ASGV分离物的一致性为89.9%~98.9%。系统发育分析结果表明,44个ACLSV分离物聚集在7个主支,其中29个塞外红苹果的ACLSV分离物分别位于JB组、Balatonl组、B6组和一个独立分支;27个ASPV分离物聚集为6支,其中12个塞外红苹果的ASPV分离物分别位于Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ组;61个ASGV分离物聚集为8个支,其中塞外红苹果的21个ASGV分离物聚集在一起,形成独立分支。【结论】ACLSV、ASGV、ASPV均能侵染塞外红苹果,并且发生率较高。与其他来源的病毒相比,塞外红苹果的3种病毒分离物,各种内各分离物彼此之间的序列一致性较好并且进化关系较近。研究结果为塞外红苹果产业绿色、健康、持续发展提供基本理论依据。

利用高通量测序检测新疆野苹果上的病毒

新疆野苹果Malus sieversii(Ledeb.)Roem.是苹果的祖先,也是重要的育种遗传资源,常用作砧木。近年来,新疆野苹果的分布面积骤减,对其的保护越来越重要。本研究采用高通量测序技术,对采自新疆伊犁天山野果林的26份样本进行病毒检测,检测到苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)和苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)。通过RT-PCR检测所有样品(127份),检测到ACLSV、ASPV和苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV),检出率分别为22%、19.7%和11%。结合RACE PCR技术扩增得到ASGV新疆野苹果分离物基因组全长序列,暂时命名为ASGV-XJ。去除3′末端poly(A)后的长度为6506 bp,有两个彼此重叠的开放阅读框(open reading frame,ORF),ORF1(47-6364 nt)编码一个241 kD的多聚蛋白,包含甲基转移酶(methyltransferase)、木瓜蛋白酶(papain-like-protease)、解旋酶(nucleotide triphosphate-binding helicase)、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)和C端的外壳蛋白(coat protein,CP)等;ORF2(4798-5760 nt)编码一个36 kD的运动蛋白(movement protein,MP)。系统发育分析表明,分离物间没有表现出寄主专一性和地理分布规律。上述结果对新疆野苹果的保护工作有重要的参考意义。

河北苹果坏死花叶病毒的发生及近全基因组序列的测定与分析

为明确苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus, ApNMV)在河北的发生及其基因组特性,本试验利用RT-PCR技术对河北保定两地ApNMV发病情况进行检测,然后通过高通量测序技术对带毒样本进行序列测定和分析。结果表明,河北农大果园‘红珍珠’‘锦锈红’‘信侬红’3个品种及保定唐县苹果实验基地富士品种ApNMV检出率分别为9.09%、18.18%、100%和65%。ApNMV阳性果树高通量测序结果显示,果树为ApNMV、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)和苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV)复合侵染,ApNMV河北分离物(ApNMV-HB)的近全基因组序列包含RNA1~RNA3序列,GenBank登录号分别为OP019626、OP019627和OP019628。RNA1编码120 kD的甲基转移酶/NTP-binding解旋酶(MET/HEL),RNA2编码97 kD的RNA聚合酶(POL),RNA3编码运动蛋白(Movement protein, MP)和外壳蛋白(Coatprotein,CP),4个基因核苷酸和氨基酸序列与代表性分离物相似性分别为89.44%~97.02%、92.14%~98.67%。系统发育关系分析表明,以ApNMV RNA1、RNA2、RNA3(CP和MP)编码的氨基酸为基础构建系统发育树,ApNMV-HB分别与AM95、AM125、XJ、ZZ亲缘关系最近。本研究首次揭示了ApNMV河北分离物的近全基因组序列,丰富了该病毒的基因组序列信息,明确了该分离物与其它分离物的系统发育关系,为进一步了解该病毒的系统发育及遗传进化提供参考。

我国北方部分苹果主产区病毒病的发生与检测

苹果病毒病在我国广泛发生,已成为限制我国苹果优质高产的关键因素。20世纪80年代曾对其做过详细的调查和研究,但近年来由于各地农业产业结构调整等因素,苹果病毒病的发生特点有了不同程度的变化。为了解目前我国苹果病毒病的发生情况,在我国北方苹果主产区山东、陕西、山西、辽宁、北京和黑龙江6个省市的部分地区采集苹果样品共计267份,经RT-PCR检测和扩增产物的克隆与测序分析表明在上述地区采集的样品中,苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果茎痘病毒（ASPV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）的发生率分别为66.7%~100.0%、38.1%~94.1%、4.8%~85.7%和4.8%~48.6%;苹果凹果类病毒（ADFVd）仅在山东的两个果园零星发生;6个省市样品中病毒复合侵染率分别为67.1%、92.1%、75.0%、88.2%、94.1%和76.2%。

两步多重RT-PCR快速检测苹果潜隐性病毒

【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法，【方法】以携带苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）和苹果茎痘病毒（ASPV）的成龄苹果树韧皮部为试材，根据基因库中苹果茎痘病毒（Apple stempitting virus，ASPV）的外壳蛋白基因序列，设计合成了2对特异性引物，分别与合成的苹果茎沟病毒（ASGV）引物和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）的引物组合配伍，筛选出最佳的引物对组合。对eDNA的合成所用引物和总RNA模板进行遴选和量化，对PCR过程中eDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。【结果】结果表明，反转录引物为Oligo（dT）18、总RNA0．1～3．0μL时，可以得到较好的eDNA；ASPV—FR与ASGV—Pch、ACLSV—Pch引物组合优于ASPV—Pch，并且筛选出4组最佳的终浓度处理组合；eDNA用量为2．0-4．0μL、退火温度为50．0～52．9℃、循环数为35时，扩增效果较好。采用优化的多重RT—PCR体系对采自陕西和山东两省的样品进行检测，并用3种病毒的单重RT—PCR体系进行验证。【结论】结果呈现高度一致性，充分印证了该多重RT—PCR体系的准确性，适用于大量样品的快速检测。

苹果脱毒方法及其病毒检测技术研究进展

介绍了热处理、化学处理和茎尖培养等苹果脱毒方法,以及指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和分子生物学技术等几种苹果病毒检测技术的研究进展。