虎杖提取物对苹果腐烂病菌的抑菌机制

本文采用乙醇热回流法提取虎杖,以苹果腐烂病菌为指示菌,利用固体培养方法研究虎杖乙醇提取物对病菌的抑制率,通过液体培养方法研究其对菌丝形态、菌丝干重等的影响,同时探究其对菌丝体内几丁质酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性、蛋白酶活性、可溶性蛋白含量及还原糖含量等一些生理生化指标的影响。结果表明,虎杖乙醇提取物对苹果腐烂病菌有明显的抑制作用。当虎杖提取物浓度达800 mg/L时,对菌丝干重的抑制率高达96.5%;抑制蛋白、葡萄糖等菌体细胞内物质的合成,其含量最高可降低为对照的45.2%和23.0%,从而使病菌代谢速度减慢,抑制其生长;使2种细胞壁相关水解酶,几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶的活性分别升高3.36和7.98倍,降解细胞壁,破坏菌体结构,使菌体自溶。

龙胆内生菌的分离鉴定及其对苹果腐烂病菌的拮抗作用

从云雾龙胆中分离到内生菌LD-b1,通过形态观察、生理生化实验和16SrDNA系统进化分析,鉴定其为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。该菌株的发酵上清液对苹果腐烂病菌的生长有显著的拮抗作用,拮抗活性物质对80℃以下的温度有一定耐受能力;在pH5～10之间均有一定活性,对低pH更敏感;50μg/mL的蛋白酶K在37℃条件下处理1h可以使其抑菌活性完全丧失。抑菌曲线测定结果表明,摇瓶发酵48h时内生菌LD-b1的抑菌活性最高,在苹果果实上对腐烂病斑也具有明显的抑制作用。

补骨脂提取物对苹果腐烂病菌的抑制作用

通过液体培养方法研究补骨脂提取物对苹果腐烂病菌菌丝生长的抑制作用,同时探究补骨脂提取物对病原菌菌丝体内几丁质酶及-β1,3葡聚糖酶活性的影响。结果表明:当补骨脂提取物浓度为5,10,20,40,80 mg·L-1时,对苹果腐烂病菌菌丝干重的抑制率分别为39.8%,62.3%,79.4%,90.6%,98.3%;用50mg.L-1补骨脂提取物处理在液体培养3d的苹果腐烂病菌,处理后1,3,6,12h菌体内几丁质酶活性分别为对照的1.32,3.62,3.34,2.47倍;β-1,3葡聚糖酶活性分别为对照的4.78,9.98,5.83,3.53倍。由此表明,补骨脂提取物对苹果腐烂病菌具有明显的抑制作用。

10种植物组织不同浸出物对苹果腐烂病菌的抑制作用

为了开发防治苹果腐烂病的植物源农药,以菊科、藜科、豆科、蔷薇科、卫矛科、唇形科、芸香科和萝摩科等10种不同植物组织的水、乙醇和石油醚浸出物,对苹果腐烂病的抑制作用效果进行了研究。结果表明,茵陈、地肤子、苦参、鸡血藤、雷公藤和地榆、杠柳、黄芩可作为防治苹果腐烂病的杀菌性植物资源,并可用水和石油醚作为其活性成分的提取剂。

苹果腐烂病菌原生质体制备与再生条件优化

大量高质量且能再生的原生质体是真菌遗传转化、基因修饰的重要保证。本试验选用苹果腐烂病菌强致病力菌株SDAU11-175,从酶种类、菌丝年龄、酶解时间、渗透压稳定剂及再生培养基五个方面对原生质体制备及再生条件进行了优化。结果显示:获得苹果腐烂病菌原生质体最大产量的条件是菌丝年龄54 h、3%崩溃酶和3%裂解酶组合、0.7 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂、28℃酶解3 h,所得原生质体在YPS培养基上再生效果最好,再生率可达42.21%。

陈皮石油醚相中抗苹果腐烂病菌活性物质研究

陈皮石油醚提取物中富含对苹果腐烂病菌(Valsa mali)具有抑菌活性的物质,研究通过反复硅胶柱层析、制备高效液相色谱、重结晶对馏分F15纯化获得了3个活性单体A、B、C。核磁共振数据显示A、B、C分别为3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮、橘皮素和川陈皮素。采用生长速率法测定A、B、C的抑菌活性,结果表明,3个化合物对苹果腐烂病菌的EC50分别为68.19、1.56、24.02μg/m L,其中橘皮素对苹果腐烂病菌的抑菌活性最强。

苹果腐烂病菌拮抗放线菌的分离与鉴定

采用常规方法对广东省中山市采集的土样进行分离,得到放线菌293株。以苹果腐烂病菌为指示菌,通过平板对峙法和管碟法对分离菌株进行筛选。对峙法获得有拮抗效果的放线菌61株,抑菌率在50%以上的有13株,其中Z-6的抑菌率达87.2%;进一步应用管碟法对上述作用明显的菌株进行复筛,抑菌圈直径大于20 mm的菌株6株,其中Z-6菌株产生抑菌圈直径最大,为32.87 mm。抑菌谱测定结果表明,该菌株对小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌和稻瘟病菌抑菌效果最强,抑制率在70%以上。离体枝条测定试验中,该菌株同样表现了一定的防治效果,抑制率达32.9%。最后,本试验还对Z-6的形态特征、培养特征及生理生化特性作了研究,初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces)的金色类群(Aureus)。

木霉菌对苹果腐烂病菌的抑制作用

通过木霉菌对苹果腐烂病菌的拮抗试验、树体接种试验及在ＰＤＡ 培养基上玻璃纸平板对峙培养试验。

木霉菌培养液对苹果腐烂病菌的拮抗作用

通过木霉菌培养液对苹果腐烂病菌的拮抗试验 ,证明了木霉菌培养液对苹果腐烂病菌有明显的拮抗作用 ,而且木霉菌培养液内含的拮抗物质对高温敏感 ,易分解失效 。

苹果腐烂病菌VmHMG基因敲除突变体获得及表型分析

苹果腐烂病菌是引起我国苹果腐烂病的主要病原真菌,对苹果产业造成了严重的经济损失。为有效控制病害的发生,本试验研究了VmHMG对苹果腐烂病菌的生长发育及致病性的影响。本研究通过融合PCR技术将苹果腐烂病菌HMG-box基因上下游片段与及潮霉素筛选标记基因Hpt片段,构建敲除载体,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化,再经潮霉素初筛、PCR扩增和Southern杂交验证,最终从95个转化子中得到2株敲除突变体Δ1-5、Δ2-22,敲除效率为2.1%。与野生菌株相比,Δ1-5、Δ2-22在菌落颜色、子实体产生等方面没有发生明显变化;突变株平均生长速率分别下降了10.8%和19.8%,但致病性分别增加了48.5%和56.2%。由此可知,VmHMG基因缺失抑制了苹果腐烂病菌的生长,增强了其致病性,对其他性状影响不明显。本研究通过获得VmHMG基因敲除突变体,初步分析了该基因的功能,为明确病菌的生长发育及致病作用机制奠定了理论基础。

补骨脂种子提取物对苹果腐烂病菌的抑菌活性研究

旨在探究补骨脂种子提取物对苹果腐烂病菌的杀菌活性及田间防效。采用菌丝生长和孢子萌发抑制率法对补骨脂种子提取物的抑菌活性进行测定,得到的EC50值分别为6.766、0.172 mg/L,说明补骨脂种子提取物对苹果腐烂病菌菌丝生长和孢子萌发均具有明显的抑制作用。田间试验表明,补骨脂种子提取物微乳剂稀释200~600倍液后,对苹果腐烂病菌引起的病斑进行刮疤涂抹处理,防治效果可达71%~81%。经田间系统观察,供试药剂在试验剂量范围内对苹果树生长发育无不良影响,使用安全。

苹果腐烂病菌有性态主要分布在高温湿润地区

据《果树学报》2013年第4期《不同生境下苹果树腐烂病菌有性态的发生及生物学特性研究》（作者陈臻等）报道，为了明确苹果树腐烂病菌有性态在不同生境条件下的发生情况及生物学特性，以甘肃省6市11县（区）不同生境条件下患病的苹果树病皮为试验材料，对苹果树腐烂病菌有性态的形态学、形成时间、侵染性和子囊孢子萌发条件等进行了研究。

苹果腐烂病菌对3种杀菌剂抗药性与敏感性检测

从陕西省洛川县10个乡镇的苹果树腐烂病树上分离获得10个菌株,用3种杀菌剂悬浮剂型对其进行抗药性和敏感性试验。结果表明,10个菌株对40%苯醚甲环唑均未产生抗药性;只有10号菌株对430g/L戊唑醇产生抗药性,其余菌株未产生抗药性;10个菌株对400g/L嘧霉胺均产生抗药性。3种杀菌剂对10个分离菌株的EC50值大小依次为400g/L嘧霉胺悬浮剂0.3790~2.1340μg/ml,430g/L戊唑醇悬浮剂0.1385~0.5239μg/ml,40%苯醚甲环唑悬浮剂0.1229~0.3313μg/ml,而其抑菌效果依次增强;10个分离菌株对苯醚甲环唑的敏感性差异最小,对嘧霉胺的最大。建议生产上防治苹果树腐烂病优先选用苯醚甲环唑。

梨和苹果腐烂病菌不同培养表型菌株的致病性分析

梨和苹果腐烂病主要发生在中国和日本，该病主要危害梨和苹果树的主干和侧枝。目前国内外对这2种腐烂病菌分类地位和致病性分化的研究十分关注。

生物药剂和化学药剂对苹果树腐烂病菌的抑制效应

为研究不同生物药剂和化学药剂对苹果树腐烂病的影响,分别以多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、多抗霉素、苦参碱4种生物药剂和戊唑醇、咪鲜胺2种化学药剂为材料,采用培养皿离体培养方式,研究单一药剂和不同药剂组合对苹果腐烂病病原菌丝生长和分生孢子萌发的抑制效应。结果表明:在培养基中添加单一药剂时,多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌浓度为180 mg/L、多抗霉素浓度为225 mg/L、苦参碱浓度为5mL/L和戊唑醇、咪鲜胺浓度为0.75mL/L时,抑菌率均可达100%。另外,0.02mL/L咪鲜胺分别与45 mg/L枯草芽孢杆菌、45 mg/L多粘类芽孢杆菌、0.045 mg/L多抗霉素以及0.02mL/L戊唑醇与45 mg/L多粘类芽孢杆菌组合,4种组合的菌丝抑菌率与孢子抑制率都达到100%,抑菌效果明显好于其他药剂组合。说明这4种生物药剂和化学药剂组合可作为高效、低毒的混合型药剂来防治苹果树腐烂病的发生。

植物提取物多羟基双萘醛对苹果腐烂病菌的抑制作用研究

研究了植物提取物多羟基双萘醛(WCT)对苹果腐烂病菌的抑制作用。平板对峙试验表明WCT对苹果腐烂病菌有较强的抑菌活性,而且随着浓度提高抑制作用增强,当浓度为50 mg.mL-1时抑菌效果较好,EC50为25.04 mg.mL-1;在果园WCT对苹果腐烂病也有很好的防治效果,苹果树在刮除病疤再涂抹WCT后能促进病疤部位形成较厚的愈合层。苹果树苗在涂抹WCT后,PPO、POD酶活性和叶绿素含量开始升高,明显高于健康对照;并且在叶片中诱导一种分子量约为59 kD蛋白大量表达,WCT处理后该蛋白的表达量比健康对照显著增加。通过基体辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)分析该蛋白,将所得的肽指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF)在SWISSPROT蛋白质数据库中比对发现该蛋白是RUBP羧化酶大亚基。以上研究结果表明WCT对苹果腐烂病菌具有一定的抑制作用和诱导寄主产生抗性的作用。

异补骨脂查尔酮对苹果腐烂病菌菌丝形态及细胞结构的影响

[目的]为开发新型高效的植物源杀菌剂,研究补骨脂活性成分异补骨脂查尔酮对苹果腐烂病菌菌丝形态和细胞结构的影响。[方法]采用扫描电镜和透射电镜观察法。[结果]异补骨脂查尔酮药剂处理可使菌丝体形态发生明显变化,2 mg/L异补骨脂查尔酮药剂处理后,苹果腐烂病菌菌丝尖端萎缩,菌丝体粗细不均匀,有膨大缢缩现象,菌丝体排列不整齐,菌丝之间相互缠绕,有溶融现象,且溶融部分细胞壁上有空洞,明显可见菌丝体的畸变与细胞壁的损伤;10 mg/L异补骨脂查尔酮药剂处理后,苹果腐烂病菌细胞壁严重破坏,线粒体膜、细胞核核膜及细胞膜界限不清晰,细胞质物质明显凝缩、外渗,细胞内液泡明显增多。[结论]异补骨脂查尔酮主要作用于苹果腐烂病菌的细胞壁及膜系统,同时伴有细胞老化现象。

苹果腐烂病病菌对银泰的抗药性风险评估

在室内用20％银泰EC对苹果腐烂病菌（Valsa mali）进行抗药性培育，从而测定该菌对20％银泰EC产生抗药性的风险。结果表明，在连续抗性培育30代后，苹果腐烂病菌未对银泰产生抗药性，F30代对F0代的抗性比值为0．897，而且其它各代抗性比值基本在0．8～1．0之间，抗性比值保持在一个比较恒定的水平，说明苹果腐烂病菌对20％银泰EC不易产生抗药性。试验同时表明，20％银泰EC对10％银果EC存在负交互抗性，银果对F30代的EC50较对F0代的EC50显著降低，抗性比为0．612，因此在防治苹果腐烂病时具有很好的互补性，可以交替轮换使用，而且会表现更好的防治效果。

苹果树腐烂病生防链霉菌A144的鉴定及其代谢产物的抑菌活性

旨在明确菌株A144的分类地位及其代谢产物的抑菌活性。基于形态学观察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析将菌株A144鉴定为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)。采用含药平板法测定菌株A144的抑菌谱,结果表明其发酵滤液对苹果树腐烂病菌(Valsa mali var.mali)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)以及番茄早疫病菌(Alternaria solani)均有抑菌活性,抑菌率分别为68.15%±2.62%、28.90%±1.79%、33.77%±2.59%和11.43%±0.81%。以苹果树腐烂病菌为指示菌,从12种不同培养基中筛选出ISP2培养基为菌株A144的最佳发酵培养基,其发酵滤液的抑菌率达85.06%±0.86%。平板涂抹法和平板对扣法试验结果表明,其脂肽粗提物、蛋白粗提物和挥发性物质对苹果树腐烂病菌均有抑菌活性,抑菌率分别为81.44%±0.92%、47.92%±2.25%和22.87%±4.40%。可见,菌株A144在苹果树腐烂病的生物防治中具有良好的开发潜力。

苹果树腐烂病菌qPCR检测方法的建立

利用ITS、β-微管蛋白和EF-1α基因序列的通用引物来扩增苹果树腐烂病菌菌株Vmm41,产物序列,与GenBank中的序列对比,设计并筛选出特异性引物对VE1-F/VE1-R。将目的片段连接到载体pUC19上制成标准品,通过优化退火温度和引物浓度,建立了实时定量PCR检测体系,并对该体系的特异性、灵敏度和可靠性进行了验证。结果表明,该体系可检测到26.4fg/μL的模板浓度,并可从苹果轮纹病菌、链格孢菌、层出镰刀菌、木霉菌和青霉菌等苹果园常见真菌中特异性的检测出苹果树腐烂病菌。用该体系对人工接种腐烂病菌的苹果叶片进行检测验证,结果表明,利用该检测体系可检测出叶片未发病部分的腐烂病菌数量。本研究建立的定量PCR检测体系可用于苹果树腐烂病菌的快速检测,为苹果树腐烂病侵染规律及预警研究提供新方法。