甘蔗细胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)叶片全长cDNA文库进行测序,获得了1个细胞质型苹果酸脱氢酶(cMDH)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-cMDH。生物信息学分析表明,该基因全长1314 bp,开放阅读框为999 bp,编码332个氨基酸。Sc-cMDH与其他植物cMDH的氨基酸序列同源性高达86.5%～97.0%。Sc-cMDH包含典型的NAD+结合基元T11GAAGQI17和催化基元I184WGNH188,还有相当保守的6个半胱氨酸残基,因此推断该基因为细胞质型NAD-MDH。定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗叶片和根中的表达量高于茎。

猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫学分析

目的对猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因(malate dehydrogenase,MDH)进行克隆,表达及免疫学特性的初步研究。方法将猪带绦虫MDH基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙基--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blot)进行免疫学分析。结果成功构建pET-28a(+)-MDH重组质粒,并获得高纯度蛋白,该重组蛋白可被其免疫SD大鼠血清识别,同时也能被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别。结论猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

一类依赖于NAD的玉米胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其序列分析(英文)

苹果酸脱氢酶普遍存在于各种生物中，它负责催化草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换。根据其辅酶的特异性和在细胞内的分布及其生理功能的不同，苹果酸脱氢酶在高等植物中可以区分出不同的类型，依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶是其中研究较少的一类。根据已发表的其他高等植物的依赖于NAD的胞质型苹果酸脱氢酶基因的保守序列，运用SMARTRACERT—PCR技术，从玉米叶片中分离了cyMDH的1264bp全长cDNA序列，通过生物信息学分析发现，该序列含有一个999bp的完整的开放阅读框，其共编码332个氨基酸（GenBank登陆号EU625276）。序列联配与树状分析结果表明，该玉米cyMDH序列与多个物种的cyMDH基因具有高度的同源性。组织特异性表达分析显示MDH基因在玉米叶片中表达量最高，在茎、根中亦有低水平表达。本研究将为更深入的研究玉米cyMDH基因的分子调控机理奠定基础。

亚洲牛带绦虫36kDa胞浆型苹果酸脱氢酶基因的表达、纯化及免疫学分析

目的对亚洲牛带绦虫胞浆型苹果酸脱氢酶基因(malate dehydrogenase,MDH)进行克隆、表达和免疫学研究。方法将亚洲牛带绦虫成虫MDH克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-30a(+)-TaMDH重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了亚洲牛带绦虫的猪血清,表明其具有免疫反应性。结论亚洲牛带绦虫苹果酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

西方蜜蜂六个亚种苹果酸脱氢酶Ⅱ基因的遗传差异

研究了西方蜜蜂Apismellifera 6亚种———浙农大 1号意蜂 (ZND A .m .ligustica)、东北黑蜂 (A .m .ssp .)、卡尼鄂拉蜂 (A .m .carnica)、喀尔巴阡蜂 (A .m .carpatica)、高加索蜂 (A .m .caucasica)和乌克兰蜂 (A .m .acervorum)苹果酸脱氢酶Ⅱ的基因型频率、基因频率和杂合纯合度。浙农大 1号意蜂、喀尔巴阡蜂和高加索蜂的纯合度较高 ,但浙农大 1号意蜂等位基因c频率最高 ,喀尔巴阡蜂等位基因b频率最高 ,高加索蜂等位基因a频率最高 ;东北黑蜂、卡尼鄂拉蜂和乌克兰蜂是高度杂合的亚种 ,但东北黑蜂等位基因a、b、c的频率差异较小 ,卡尼鄂拉蜂和乌克兰蜂主要存在a、c两个等位基因 ,b出现频率很小 ;6亚种的基因型频率、基因频率和杂合纯合度都有极显著差异。这些差异将从遗传和生化角度为西方蜜蜂 6个亚种的鉴别提供依据。

西方蜜蜂6个亚种正反交苹果酸脱氢酶Ⅱ基因的遗传差异

研究了西方蜜蜂(ApismelliferaL.)的浙农大1号意蜂、东北黑蜂、卡尼鄂拉蜂、喀尔巴阡蜂、高加索蜂和乌克兰蜂6个亚种及浙农大1号意蜂与其它5个亚种正反交杂交组合苹果酸脱氢酶Ⅱ的基因型频率、基因频率和杂合纯合度,并分析了杂交后代与亲本的关系。浙农大1号意蜂、喀尔巴阡蜂、高加索蜂的纯合度较高,而东北黑蜂、卡尼鄂拉蜂和乌克兰蜂是高度杂合的亚种。杂交子代与母本的差异小于与父本的差异。正反交杂交组合基因型频率、基因频率的差异程度与亲本的杂合度有关。

四个意大利蜜蜂品系苹果酸脱氢酶Ⅱ基因的遗传差异分析

研究了意大利蜜蜂(A.m.ligustica)4个王浆、蜂蜜生产性能不同品系—美意(Em)、澳意(Eo)、苏意(Es)和平湖浆蜂(Ep)的MDHⅡ同工酶基因型频率、基因频率及杂合纯合度.试验发现,MDHⅡ的a、b、c三个等位基因在4个品系中出现的频率不同.c在Em、Eo、Es和Ep中的基因频率分别为0.507、0.483、0.680和0.820,为优势等位基因.该结果表明在产浆性能高的品系中c基因频率较高,意味着可将c基因频率作为意蜂王浆产量性能的一个遗传标记.等位基因a在Em、Eo、Es和Ep中频率分别为0.323、0.263、0.193和0.087;在Em中出现的频率最高.而等位基因b在Eo中频率(0.253)高于其他3个品系(Em,0.170; Es,0.127;Ep,0.093).Ep的纯合度最高,达0.753,高于Em(0.533)、Eo(0.633)和Es(0.540).经独立性检验,4个意蜂品系MDHⅡ同工酶的基因型频率、基因频率、纯合度均达到极显著差异水平.

香橙苹果酸脱氢酶CjMDH基因表达特性及转基因烟草的耐铝性分析

为研究柑橘砧木香橙对酸性土壤的适应机理,从‘资阳香橙’根cDNA文库中随机测序克隆了苹果酸脱氢酶基因CjMDH(GenBank accession No.ABI75147)。该基因cDNA序列长1368bp,其开放阅读框为1239bp,推测其编码412个氨基酸残基,在编码氨基酸序列中存在1个苹果酸脱氢酶的NAD结合位点和8个苹果酸结合位点,iPSORT分析表明该基因编码氨基酸序列N端存在叶绿体转移肽。同源性分析显示CjMDH与拟南芥、烟草、大豆、豌豆、水稻、苜蓿等植物的MDH一致性约为80%,相似性在85%以上。在与苹果酸脱氢酶功能有关的NAD和苹果酸结合位点处氨基酸残基高度保守,表明这两个区域是MDH重要的功能区。Northern blot和Real-time RT-PCR分析结果表明该基因在香橙根和叶中优势表达,在根中表达量最高,茎中表达最低。将CjMDH基因构建到组成性启动子CaMV35S驱动的载体中,对烟草进行转化,从转基因烟草株系中筛选获得了3个CjMDH基因高表达的株系。将表达量高的转基因株系进行耐铝试验,初步结果表明在烟草中超量表达CjMDH可以提高植株对铝毒的耐受能力。

黏类小麦细胞质雄性不育相关基因cMDH的克隆与表达分析

为深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制,利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的二核期SSH文库。经文库筛选后,得到一个在可育文库中表达的与胞质苹果酸脱氢酶基因同源的EST序列。以该EST序列为信息探针,经电子克隆、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了小麦胞质苹果酸脱氢酶(cytosolic malate de-hydrogenases,cMDH)基因的cDNA与DNA序列,利用荧光定量PCR技术对该基因在不育株和可育株花药中的表达进行了分析,并比较了MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化。结果表明,该基因的cDNA序列长1213bp,编码333个氨基酸;DNA序列长2908bp,含有7个外显子和6个内含子;该基因在不育株和可育株花药发育3个时期(单核、二核和三核)的表达均表现为先升后降的模式,而且该基因在不育株花药发育的二核期和三核期的表达相对于可育株被明显抑制;MDH在小麦不育株和可育株中的活性变化趋势与定量结果一致。推测该基因在花粉发育早期表达,它的下调表达可能影响了小麦雄蕊发育过程中的能量供应而导致雄性不育。

YDL080C和LEU2基因敲除对工业黄酒酵母异戊醇生成量的影响

通过敲除生成途径中关键酶的编码基因,对异戊醇在工业黄酒酵母N85中的生成进行了研究。采用融合PCR技术,分别构建类丙酮酸脱羧酶基因(YDL080C)缺失组件"YDL080C-URA3-YDL080C"和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)缺失组件"LEU2-URA3-LEU2",转化工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体Na-u(MATa ura3),获得单倍体工程菌Na-y和Na-l。将转化子与亲本分别进行实验室规模的黄酒发酵实验,结果 YDL080C缺失工程菌的异戊醇含量与亲本相比没有明显变化,说明类丙酮酸脱羧酶不是该途径关键酶;LEU2缺失工程菌的异戊醇含量降低16.16%,说明糖代谢途径存在,但只占小部分,而其他理化指标无明显差异。

牡丹PsMDH基因的克隆、表达及载体构建

以牡丹品种赵粉为试材,采用RT-PCR和RACE方法从雄蕊中获得了一个牡丹苹果酸脱氢酶基因cDNA全长,命名为PsMDH,GenBank登录号为HQ449567。其cDNA全长1 283 bp,包含80 bp的5'非编码区、203 bp的3'非编码区和一个长度为999 bp编码332个氨基酸的开放阅读框。序列比对和系统进化分析表明,PsMDH与毛果杨的亲缘关系最近,相似性达93.37%以上。相对荧光定量PCR分析表明,PsMDH在心皮中的表达量最高,在雄蕊中表达量最低。成功构建植物表达载体,为牡丹品种改良提供基础。