用苹果酸通透酶基因的特异性引物进行酒酒球菌快速鉴定(英文)

以Oenococcus oeni苹果酸通透酶基因为目标基因,设计了1对特异性引物PmlepL/PmlepR进行酒酒球菌的快速鉴定研究。结果表明,直接以O.oeni的菌落为模板,通过PmlepL/PmlepR引物的PCR扩增,可得到苹果酸通透酶基因的特异性条带;用此特异性引物进行供试乳酸菌的PCR鉴定,所有O.oeni菌系均得到特异性条带,而供试的其他种类乳酸菌未扩增出目标带。引物PmlepL/PmlepR可用于O.oeni的快速PCR鉴定。

粟酒裂殖酵母降苹果酸基因克隆及其序列分析

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)由于可降解苹果酸(malo-ethanolic fermen-tation)而被广泛应用于葡萄酒等果酒的酿造。其生理活性依靠的是苹果酸通透酶(MAE1)和苹果酸酶(MAE2)2个关键酶的作用。以粟酒裂殖酵母基因组DNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术,扩增得到苹果酸通透酶基因(mae1)和苹果酸酶基因(mae2),并插入到pMD-T载体中,转化大肠杆菌得到相应的转化子。测序后分析表明,扩增的mae1基因与mae2基因序列与已报道的序列同源性均为99%,mae1基因编码的氨基酸序列中有2个与报道不同;mae2基因编码的氨基酸中有3个与报道不同。

酒类酒球菌mleP基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

苹果酸通透酶具有协助苹果酸 乳酸发酵 (MLF)的重要功能。以酒类酒球菌 (Oenococcusoeni)优良菌系Oenococcus Lee SD 2a的总DNA为模板 ,用PCR方法克隆到苹果酸通透酶基因mleP ,构建了重组质粒pBMmleP。序列分析表明克隆到的基因序列与已报道的序列同源性为 99%。为使目的基因在酿酒酵母中表达 ,以大肠杆菌 酿酒酵母穿梭质粒YEp35 2为载体 ,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件 ,构建了重组表达质粒YEpmleP ,并转化酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)YS5 8。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。获得的转化子在添加了L 苹果酸 (5g L)的培养基中培养 4d ;取培养液上清用HPLC检测 ,结果显示重组转化子YSP的培养液中L 苹果酸剩余含量均低于空载体转化子YS35 2 。

菌落PCR技术在重组质粒筛选与鉴定中的应用

应用以菌落为模板的聚合酶链反应(PCR)技术,筛选插有酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA和苹果酸通透酶基因mleP序列的重组阳性克隆,筛选到的阳性克隆分别扩增到约1600bp及900bp的条带,且与两个目的基因片段大小一致。提取阳性克隆的质粒进一步进行双酶切(EcoR -Kpn )及质粒PCR鉴定,证明结果正确。菌落PCR技术的应用使重组质粒的筛选和鉴定得以优化和简化。