牡丹茄腐镰刀菌FSH基因组中GATA类转录因子的鉴定与分析

牡丹根腐病主要是由茄腐镰刀菌(Fusarium solani)引起的,对牡丹种植区危害很大.GATA转录因子在病原真菌的定殖和致病过程中发挥重要作用.在牡丹茄腐镰刀菌FSH基因组中共鉴定出6条GATA类转录因子,它们均定位于细胞核中.在这6条GATA类转录因子编码的蛋白质中,有4个碱性蛋白(g2237.t1,g4943.t1,g6316.t1和g677.t1),1个酸性蛋白(g3670.t1)和1个中性蛋白(g13425.t1).这6个蛋白质均为亲水性和不稳定蛋白,它们编码的氨基酸数目区间为435~1025.保守结构域分析发现,这6个蛋白质除含有ZnF-GATA结构域外,g13425.t1还编码两个PAC结构域,g13425.t1和g3670.t1编码有PAS结构域;三级结构预测显示这6个蛋白质均无信号肽序列.研究阐述了牡丹茄腐镰刀菌FSH基因组中的GATA类转录因子基因及其生物信息学特征,以期为后期研究该类转录因子的功能提供一定的理论基础.

芦笋试管苗移栽中茄腐镰刀菌的发生与为害

通过柯赫法则试验证明,芦笋试管苗在椰糠基质上移栽成活率不高是由于猝倒病发生为害造成的,茄腐镰刀菌(Fusarium.solani.Sacc.)是该病的病原菌。抑制圈试验结果初步表明:50%多菌灵可湿性粉剂和45%根病治可湿性粉剂具有较好抑菌效果。

三七根中茄腐镰刀菌的实时荧光定量PCR检测

目的建立一种准确、快速地检测三七Panax notoginseng根腐病病原真菌茄腐镰刀菌Fusarium solani的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法。方法基于茄腐镰刀菌的氨基己二酸还原酶(Lys2)基因设计了qRT-PCR的特异性引物对Fs-QF和Fs-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了茄腐镰刀菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法和实时荧光环介导恒温扩增技术(LAMP)体系。从三七种植区采集到15个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用建立的检测方法进行检测。结果建立的qRT-PCR检测方法和实时荧光环介导恒温扩增技术特异性强,能快速检测到携带茄腐镰刀菌的三七根腐病病株。此外,该方法灵敏度高,检测模板质量浓度可低至0.2 pg/μL。结论建立的方法能明确三七种植土壤以及三七病株中茄腐镰刀菌数量的动态变化。可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及为带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。

丹东草莓根腐病病原菌鉴定及生物学特性研究

以丹东各草莓主产区采集的10份根腐病病样为试材,采用组织分离法、形态学及分子生物学鉴定法,探讨了丹东地区草莓根腐病病原菌种类。结果表明:该病病原菌菌株为茄腐镰刀菌(Fusarium solani)。进一步对该病原菌生物学特性分析,该病原菌最适宜温度25~30℃、最适宜pH 6~7、光照对菌丝生长速率无显著性影响。

辣椒根腐病菌生物学特性研究

对辣椒根腐病病原菌进行了生物学特性的初步研究。试验结果表明,病菌菌丝在大多数培养基中均能良好生长,而在马铃薯酵母膏琼脂培养基上生长较为缓慢;菌丝在10～35℃范围内均能生长,最适为25℃;菌丝生长的pH值范围为3～12,最适pH值为7;光照对菌丝生长影响不大;菌丝致死温度为64℃、10min。病菌在马铃薯斜面上易于产孢,且产生的大多为大型分生孢子,而在PSA斜面上产生的以小型分生孢子为主;在其他测试培养基上不易产孢。病菌分生孢子在各种营养物质中均能萌发;萌发温度范围为15～35℃,最适温度30℃;pH值3～12间病菌孢子均能萌发,最适pH值为7;分生孢子致死温度为58℃、10min。

拮抗细菌Bs-0728对板蓝根根腐病的防治作用

[目的]筛选对板蓝根根腐病有较强拮抗作用的生防菌株。[方法]采用平板对峙法对137个板蓝根根际土壤样本中分离到的201株拮抗细菌进行测试。[结果]筛选出1个对板蓝根根腐病菌有强烈抑制作用的菌株Bs-0728。结合显微镜观察确定Bs-0728菌株对板蓝根根腐病的主要致病菌茄腐镰刀菌(Fusarium solani)菌丝生长有较强的抑制作用,导致菌丝生长畸形,弯曲,部分细胞膨大。田间试验结果表明,Bs-0728的发酵液田间防效达72.97%,且增产86.26%。经形态观察、生理生化反应及16S rDNA序列分析,初步将此拮抗细菌鉴定为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis。[结论]枯草芽孢杆菌Bs-0728菌株是一株很有应用前景的生防菌株。

茶枯发酵液对花生果腐病菌的拮抗作用

采用菌丝生长速率法和抑制孢子萌发法,测定茶枯发酵液对花生果腐病菌茄腐镰刀菌(Fusarium solani)的抑制作用,并研究了高温对茶枯发酵液抑菌效果的影响。结果表明,茶枯发酵液对茄病镰刀菌的生长具有较强的抑制作用,浓度为10g/L时抑菌活性最高,菌丝生长抑制率为83.29%,产孢抑制率为77.26%;发酵液浓度为10g/L、135℃灭菌5min时,抑菌活性仍然达到66.22%。茶枯发酵液有较好的抑菌效果和良好的稳定性,具有潜在的开发价值和应用前景。

乌头根腐病根际拮抗细菌筛选与鉴定

目的:筛选一株对乌头根腐病病原镰刀菌具有拮抗效果的根际细菌。方法:以四川省绵阳市江油乌头栽培基地的健康乌头根际土壤和实验室保留的三株乌头根腐病病原镰刀菌:茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)和层出镰刀菌(F. proliferatum)为供试材料,利用平板对峙方法筛选对三株病原镰刀菌具有拮抗活性的根际细菌,并利用16S rDNA分子鉴定方法确定筛选菌株的属种。结果:从根际土壤中筛选得到对三株病原镰刀菌均有拮抗活性,且活性较强的根际细菌仅有6株,其中A3-18菌株对三株病原镰刀菌的抑制率分别为54.21±2.14、68.35±1.27和53.05±2.45,均大于50%,故挑选A3-18菌株作后续实验分析,发现随着时间增长,A3-18菌株抑制效果也逐步增强,对尖孢镰刀菌的抑制效果尤为显著。A3-18菌株经16S rDNA分子鉴定确定为芽孢杆菌属Bacillus spp.菌株。结论:经平板对峙及分子鉴定,确定对三株乌头根腐病病原镰刀菌具有较好拮抗活性的根际细菌为芽孢杆菌属菌株。

黄芪根腐病菌分离鉴定及细胞壁降解酶活性比较

为了明确甘肃渭源黄芪根腐病致病菌的类型及致病力分化情况.采集具有典型黄芪根腐病状的植株并分离得到6株病原真菌,分别编号为GF1、GF2、GF3、GF4、GF5、GF6.通过形态特征和DNA-ITS及EF-1α两组基因序列分析对6株病原真菌进行鉴定,并比较了其生长速率、产孢量和致病力.对6株病原真菌的4种纤维素酶(Cx、βG)和2种果胶酶(PG、PMG、PGTE、PMTE)的酶活力进行了测定.6株黄芪根腐病原菌均为茄腐镰刀菌(Fusarium solani);菌株GF3的致病力最强,接种7 d后的病斑直径为1.43 cm,且菌株GF3的生长速率最快,培养9 d后的菌落直径为8.5 cm,培养10 d后的产孢量最大,为7.5×10^(8)个/皿;6株病原菌产果胶酶的活性均高于纤维素酶的活性,其中菌株GF3产生的的酶活力均高于其他菌株,产2种纤维素酶(Cx、βG)的酶活力也均高于其他菌株.甘肃渭源黄芪根腐病致病菌的主要类型为茄腐镰刀菌(Fusarium solani),其中菌株GF3的致病力最强,且其产的2种果胶酶(PG、PMG)和纤维素酶(Cx、βG)的酶活力高于其他菌株.

贵州山豆根根腐病病原菌鉴定

【目的】明确贵州山豆根根腐病的病原菌种类,为山豆根根腐病的防治及抗病育种提供理论基础。【方法】采用保湿培养法和组织分离法对感染根腐病的山豆根植株组织进行病原菌分离和纯化,根据柯赫氏法则对代表性菌株进行致病力测定;结合形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定。【结果】从收集的病株组织样本中共分离获得200株真菌菌株,选取在PDA培养基上菌落形态差异明显的67株菌株进行ITS测序并在NCBI数据库进行BLASTn比对分析,结果显示,67株菌株中包含尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)35株、茄腐镰刀菌(F.solani)7株、粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)23株和帚状弯孢聚壳(Eutypella scoparia)2株。致病性测定结果表明,尖孢镰刀菌代表性菌株和茄腐镰刀菌代表性菌株均可侵染山豆根引起典型的根腐病症状,且茄腐镰刀菌致病性明显强于尖孢镰刀菌。结合形态学特征和分子生物学鉴定结果,确认分离得到的病原菌分别为尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌。【结论】贵州山豆根根腐病主要由尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌复合侵染引起。

榆树脐腹小蠹坑道真菌研究

对脐腹小蠹幼虫坑道和成虫羽化坑道真菌进行分离培养,共分离鉴定出真菌18属。其中,从幼虫坑道中分离到12属真菌,从成虫坑道中分离到真菌10属。幼虫坑道和成虫坑道所分离到的真菌种类组成有所不同,幼虫坑道真菌种类较丰富,二者共有的属4个,幼虫坑道特有的属有8个,成虫坑道特有的真菌6属。茄腐镰刀为脐腹小蠹虫坑道优势真菌,在幼虫坑道、成虫羽化坑道中的平均分离率分别为98.84%、67.50%。

连作和感病对烟株根际土壤真菌群落结构的影响

【目的】了解连作及其与根腐病感染对烟株根际土壤真菌群落结构及多样性的影响,为连作土壤微生态环境定向调控和根腐病精准防治提供理论依据和技术指导。【方法】分别选取连作2,4和8年烟田健株(依次记为HT2、HT4、HT8)和根腐病感病烟株(依次记为ST2、ST4、ST8)根际土壤,以同区域撂荒2年以上耕层土壤为对照(CK),测定不同处理土壤理化性质,利用高通量测序技术分析不同连作年限烟田健株和病株根际土壤真菌群落组成和多样性的差异,并基于冗余分析探讨了土壤化学性质与真菌群落分布的相关性。【结果】与对照(CK)相比,连作和感病降低了烟株根际土壤真菌群落的丰富度和多样性。健株根际土壤真菌优势菌群累积相对丰度总和小于病株。属水平上,连作2年和4年烟田健株和病株根际土壤镰刀菌属(Fusarium)相对丰度增幅为81.3%~665.1%,随连作年限的延长,健株和病株根际土壤淡紫紫孢菌属(Purpureocillium)相对丰度降幅为295.2%~1387.1%;种水平上,健株和病株根际土壤茄腐镰刀菌(Fusarium solani)相对丰度增幅为88.5%~844.3%。土壤指示物种相对丰度随连作年限的延长而降低。土壤化学性质与真菌群落丰度密切关联,其中pH值和速效钾含量是影响连作和感病烟株根际土壤真菌群落分布的核心环境因子。【结论】连作和感病降低了烟株根际土壤真菌群落及有益菌群落的丰富度和多样性,但提高了病原菌的相对丰度,茄腐镰刀菌可能是引起试验烟株根腐病的主要病原菌。

三七内切-β-1,4-葡聚糖酶基因PnCel1的表达及功能分析

内切-β-1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-β-glucanases,EGases)广泛参与植物细胞壁的编辑,在组织伸长、果实成熟和脱落等过程中起重要作用。该研究采用RT-PCR方法,从三七(Panax notoginseng)中克隆了1个EGases基因(PnCel1),并对其进行表达和功能分析。结果显示:(1)外源茉莉酸甲酯、水杨酸、赤霉素、脱落酸和乙烯利处理显著诱导PnCel1的表达,而根腐病菌茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)以及交链格孢(Alternaria alternata)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)侵染三七后显著抑制PnCel1的表达。(2)亚细胞定位分析表明,PnCel1-GFP融合蛋白定位于洋葱表皮细胞的细胞壁中。(3)采用染色体步移技术克隆出PnCel1的启动子序列[(-1)~(-828)bp],进而成功构建PnCel1启动子驱动的β-葡萄糖醛酸酶植物表达载体(pBI121-PPnCel1-GUS)并转入烟草(Nicotiana tabacum L.),经PCR筛选鉴定获得阳性转基因烟草7株。(4)GUS活性检测结果表明,5种植物激素能诱导PnCel1的启动子活性,但茄腐镰刀菌等4种病原菌侵染明显降低了PnCel1启动子的转录活性,且PnCel1启动子受三七WRKY转录因子PnWRKY5/9/12/15/27的负调控。(5)PnCel1过表达转基因烟草与野生型烟草相比,对茄腐镰刀菌的易感性增加,木质素含量降低,表明PnCel1可能参与改变细胞壁的结构。研究表明,植物激素能上调三七根中PnCel1的表达,而病原菌侵染降低了PnCel1的表达水平,并抑制PPnCel1的活性,推测三七PnCel1可能通过改变细胞壁结构而增加三七对根腐病菌的易感性。

曼陀罗内生真菌Fusarium solani MBM-5活性次级代谢产物研究

该文对木本曼陀罗内生真菌Fusarium solani MBM-5(茄腐皮镰刀菌)的次级代谢产物进行了化学及生物活性研究。运用多种色谱方法(如开放ODS柱色谱、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及半制备型HPLC等),从F.solani MBM-5培养物的乙酸乙酯萃取物中共分离得到6个烯酸类化合物,包括1个新化合物和5个已知化合物。利用化合物的理化常数和波谱学(UV、IR、NMR、HR-ESI-MS等)方法及Mosher′s反应,鉴定了化合物结构,分别为fusaridioic acid E (1)、fusaridioic acid C (2)、fusaridioic acid A (3)、L660282 (4)、hymeglusin (5)、hymeglnone (6),其中化合物1为新化合物。采用MTT法和Griss法,分别评价了所有化合物对2种肿瘤细胞的生长抑制作用,以及对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7释放NO的影响及其抗炎作用。实验结果表明,化合物5对A549和HepG2细胞株具有较强的生长抑制活性(IC_(50)分别为4.70、13.57μmol·L^(-1)),并且化合物1和6可显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞的NO释放量,其IC_(50)分别为77.00、70.33μmol·L^(-1)。

马铃薯茎线虫的培养

采用茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)培养马铃薯茎线虫,在20℃黑暗条件下培养43d,直径9cm的培养皿每皿活线虫总数平均为23,777条/皿;在25℃黑暗条件下培养周期43d,每皿一次可培养出46,000至72,000条线虫,平均60,777条。与Young和Seung的培养结果(10,000条/皿)[1]相比每皿多50,000条左右,而且培养的线虫聚集在培养皿盖上,方法简单,培养量大,含杂质少。

三七NAC转录因子基因PnNAC1的克隆及表达特性分析

为了揭示三七抗病防卫反应的调控机制,对三七的一个NAC转录因子的全长cDNA进行了克隆和表达特性分析。以一年生三七幼苗为材料,根据编码NAC转录因子的三七转录组Unigene设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到一个新的NAC转录因子基因,命名为PnNAC1。序列分析表明,该基因全长815 bp,含有24 bp的5'非翻译区和215 bp的3'非翻译区,以及576 bp开放阅读框,共编码191个氨基酸,具有保守的NAC结构域。实时荧光定量PCR结果显示茉莉酸甲酯预处理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的转录水平,接种茄腐镰刀菌后,PnNAC1的表达进一步上升,在接种后4 h转录水平达最大值;无菌水预处理的三七中,PnNAC1也快速响应茄腐镰刀菌的侵染,但表达水平明显低于茉莉酸甲酯预处理的样品。接种人参链格孢后PnNAC1在叶片的表达量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水杨酸和过氧化氢4种信号分子处理三七根部均诱导PnNAC1的表达。表明PnNAC1响应几种逆境相关信号分子,并参与三七对茄腐镰刀菌和人参链格孢的防卫反应。

三七病程相关蛋白基因PnPR1的表达特性以及功能分析

该实验采用定量逆转录PCR(Quantitative reverse transcription-PCR)方法分析三七[Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen]病程相关蛋白(pathogensis related protein,PR)基因PnPR1的表达谱,并构建PnPR1的植物超表达载体,通过根癌农杆菌介导转入烟草(Nicotiana tabacum)中过量表达。结果表明:(1)外源茉莉酸甲酯预处理三七根部,能显著提高茄腐镰刀菌(Fusarium solani)侵染过程中PnPR1基因的表达量。(2)4种信号分子茉莉酸甲酯、水杨酸、过氧化氢和乙烯利处理均能够不同程度地提高PnPR1基因在三七根中的表达水平,但3种信号分子抑制剂处理三七根部后PnPR1的表达量下调。(3)PnPR1在T_(2)代转基因烟草中稳定表达,并且转基因烟草株系对茄腐镰刀菌的抗性显著提高。研究认为,PnPR1基因在转录水平上响应茄腐镰刀菌的侵染,并受茉莉酸甲酯等信号分子的诱导,在烟草中过表达PnPR1基因可增强对茄腐镰刀菌的抗性,表明PnPR1是三七应对根腐病菌防卫反应中的抗病基因。

三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的功能分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是植物抗病防御系统的重要组成部分。在前期研究中,从三七中分离得到一个编码PGIP蛋白的基因PnPGIP,PnPGIP在转录水平响应三七根腐病菌茄腐镰刀菌的侵染。为深入分析PnPGIP的功能,构建PnPGIP的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行大量表达,纯化获得PnPGIP的重组蛋白,并进行体外平板抑菌试验;构建PnPGIP的植物超表达载体,通过根癌农杆菌介导产生了PnPGIP转基因烟草,分析T2转基因烟草离体叶片对茄腐镰刀菌的抗性。PnPGIP原核重组蛋白对茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌、核盘菌和轮枝状镰刀菌的菌丝生长具有很强的抑制作用,并且随着蛋白量的增加,抑制活性也逐渐增强。q RT-PCR分析结果显示,PnPGIP在T2转基因烟草中大量表达。此外,与野生型烟草相比,转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性显著增强。PnPGIP是三七中参与茄腐镰刀菌防御反应的重要抗病基因。

中国番木瓜枯萎病病原菌的首次鉴定

从发病的番木瓜茎基部组织分离培养得到纯分离物,采用形态学和分子生物学方法进行分离物鉴定。经过致病性测定证实,分离物确定为番木瓜枯萎病的病原菌;通过形态学观察表明,与茄腐镰刀菌(Fusarium solani)形态一致。根据真菌的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)的保守性和变异性,采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,然后将PCR产物纯化后直接测序,对测试菌株与10株来自GenBank中的菌株ITS序列进行聚类分析,结果表明,测试菌株与GenBank上注册的茄腐镰刀菌GU134886、GQ451337、EU625405、EF534183和GQ376115聚在同一分枝上,分子鉴定结果与形态学观察结果一致,此为国内首次报道。

三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆及表达分析

目的克隆三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)基因(Pn PGIP)的全长c DNA序列,分析该基因的表达特性。方法根据三七中编码PGIP的EST(expressed sequence tag)序列设计引物,采用c DNA末端快速扩增技术克隆Pn PGIP基因的全长c DNA序列;用q RT-PCR分析Pn PGIP基因的表达水平。结果 PnPGIP基因的cDNA全长为1 171 bp,含有981 bp的开放阅读框,13 bp的5’-非翻译区以及177 bp的3’-非翻译区,编码含326个氨基酸的蛋白质,PnPGIP蛋白的相对分子质量约为36 770,等电点约为5.83;q RT-PCR分析结果显示,Pn PGIP基因的表达量分别在三七接种茄腐镰刀菌和人参链格孢后4 h和2 h内迅速上升;此外,信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)、乙烯利(ethylene,ETH)、H2O2、水杨酸(salicylic acid,SA)处理均能不同程度地诱导Pn PGIP基因的表达水平。结论 PnPGIP基因在转录水平响应茄腐镰刀菌和人参链格孢的侵染,并受几种逆境胁迫相关信号分子的诱导,Pn PGIP基因可能参与三七对茄腐镰刀菌和人参链格孢的防卫反应。