茄链格孢Alternaria solani DT-15除草活性及生物学特性初步研究

为了筛选获得高效除草生防菌株,本研究以青海省大通县野薄荷病样中分离到的DT-15菌株作为研究对象,对其进行离体致病性测定、活体除草效果评价、安全性评价、菌株分类鉴定及菌株最适碳氮源筛选研究。离体条件下DT-15菌株对3种杂草的致病性由强到弱依次为密花香薷>冬葵>藜。盆栽条件下藜、冬葵发病率高达91%以上,鲜重防效达94%以上,且对主栽作物蚕豆、小麦、豌豆、油菜表现为相对安全。菌株DT-15鉴定为茄链格孢Alternaria solani。对菌落直径、孢子悬浮液的OD值进行了测定,结果表明:小麦麸皮是最适的碳源,硝酸钠是最适的氮源。DT-15菌株具有蚕豆、小麦、豌豆、油菜田防除部分阔叶杂草的微生物除草剂开发潜力。

吡唑醚菌酯与苯醚甲环唑混合物对茄链格孢的联合毒力及其对马铃薯产量的影响

为明确吡唑醚菌酯与苯醚甲环唑混合物对茄链格孢Alternaria solani毒力的增效作用,采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑及其不同比例混合物对茄链格孢的毒力,以Wadley公式评价其联合毒力,并通过田间试验评价了混合物对马铃薯早疫病的防治效果及其对马铃薯产量的影响。结果表明:吡唑醚菌酯与苯醚甲环唑质量比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、1∶2和1∶5的混合物对抑制菌丝生长表现为增效,其中配比1∶2的增效最明显,增效系数(SR)为2.05,但该配比混合物对抑制分生孢子萌发仅表现为相加作用(SR 1.29)。在田间药效试验中,配比为1∶2的混合物对马铃薯早疫病的防效显著高于相同剂量的单剂及其他常用药剂的防效,增产率达46.8%,亦显著高于对照药剂。

茄链格孢培养滤液抗菌活性物质的研究

研究表明，茄链格孢（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｏｌａｎｉ）培养滤液中存有抗菌活性物质。采用改进Ｂａｒｔｅｌｓ－ｋｅｉｔｈ方法对该物质进行了提取分离并进行抗菌活性跟踪。对纯品通过熔点测定、元素分析及１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ、１Ｈ，１Ｈ－ＣＯＳＹ及ＤＥＰＴ光谱解析，证明该物质为交链孢酸（Ａｌｔｅｒｎａｒｉｃａｃｉｄ）。离体试验结果表明，０．１μｇ／ｍｌ交链孢酸对Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ，Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ菌丝生长抑制率分别为６４．３％和７３．６％。Ｍ．Ｉ．Ｃ值≤１００μｇ／ｍｌ。５００μｇ／ｍｌ交链孢酸对Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ分生孢子萌发没有影响，但可明显抑制孢子萌发后芽管的伸长，≥１０μｇ／ｍｌ时可完全抑制Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ菌核萌发。活体试验表明，５００μｇ／ｍｌ交链孢酸对黄瓜灰霉病和油菜菌核防治效果分别为８２．７％和８３．３％。

茄链格孢菌侵染马铃薯叶片过程的细胞学观察

采用光学显微镜和电镜技术系统研究了茄链格孢菌对马铃薯叶片的侵染过程及超微结构特征。结果表明:接种2h后,分生孢子开始萌发,分生孢子各个位置都可萌发产生芽管;接种6h后,菌丝顶端出现附着孢;接种8h后,菌丝从细胞间凹陷处直接侵入感病品种东农303叶片表皮细胞内;接种24h后,受侵染寄主细胞中的菌丝向相邻细胞扩展蔓延,感病品种细胞内含物及各类细胞器基本完全消解。在抗病品种克新1号上,茄链格孢菌的侵染情况与感病品种基本一致,但发生时间明显较感病品种推迟,寄主细胞内的菌丝数量明显少于感病品种;并且在接种24h后出现细胞壁加厚的防卫反应,在感病品种上没有观察到防卫反应现象。说明抗病品种对茄链格孢菌具有一定的抗侵入和抗扩展能力。

茄链格孢在人工培养基上产毒规律的研究

本项研究观察了番茄早疫病菌在PD液体培养基上毒素产生的规律.结果表明,随着培养时间的加长,毒素的致病力迅速增长,培养40天时致病力达最高值,再延长培养时间,毒力开始逐渐降低.滤液的透光率基本上可反映毒素的含量,透光率达最低值时,滤液中毒素含量最高.

8种菌株代谢物对茄链格孢菌菌丝生长及孢子萌发的抑制

为防治由茄链格孢菌(Alternaria solani)引起的番茄早疫病,研究了8株有益微生物的代谢产物对茄链格孢菌菌丝生长及孢子萌发的抑制,并且测定了曲霉、细黄链霉菌对病菌的持续抑菌作用。结果发现5株芽孢杆菌代谢物原液对茄链格孢菌菌丝生长均有一定的抑制作用,茄链格孢菌分生孢子萌发的受抑制率分别为:地衣芽孢杆菌44.87%、胶冻样芽孢杆菌51.97%、枯草芽孢杆菌55.44%。细黄链霉菌对茄链格孢菌具有较强的持续抑制作用,且黑曲霉、米曲霉、细黄链霉菌作用后茄链格孢菌菌丝发生了畸变、原生质浓缩等现象。表明8种微生物代谢物对茄链格孢菌具有抑菌活性,且效果明显。

罗丹明6G荧光探针研究茄链格孢菌对啶酰菌胺的敏感性

在pH=6的弱酸性介质中,十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）可使罗丹明6G的荧光增强,加入啶酰菌胺可使其荧光猝灭,荧光猝灭强度△F与啶酰菌胺的含量成线性关系,据此建立了测定啶酰菌胺的荧光分析新方法。采用该方法测定茄链格孢菌对啶酰菌胺的敏感性,线性范围为0.1~4μg/mL,检出限为2.9×10-5μg/mL,茄链格孢菌对啶酰菌胺吸收量为1.628时,抑制率为59.82%。该法测定的吸收量与传统方法测定的抑制率呈极显著的线性相关（r=0.947,P〈0.01）,说明两种方法没有显著性差异。

AsSod基因调控茄链格孢致病性及对胁迫的响应

由茄链格孢Alternaria solani引起的马铃薯早疫病是马铃薯生产上的重要病害之一,可导致马铃薯大面积减产,进而造成巨大的经济损失。本研究在获得缺失AsSod基因的茄链格孢突变株(ΔAsSod)的基础上,对ΔAsSod进行了不同的胁迫处理。结果表明,相比于野生型菌株和回复株,突变株ΔAsSod对细胞壁胁迫因子SDS以及渗透胁迫因子KCl、NaCl、山梨醇的耐受性均减弱。进一步分析发现,ΔAsSod对外源过氧化物胁迫更敏感,胞内过氧化物酶和漆酶活性均显著降低。在对突变株孢子萌发和致病力的研究中发现,突变株ΔAsSod的孢子萌发率显著低于野生型菌株和回复株。同时,突变株ΔAsSod的致病力也显著降低,表明AsSod基因在茄链格孢对外界胁迫的耐受性、孢子萌发和致病性方面发挥重要的作用。

茄链格孢毒素的抑菌除草活性测定

采用生长速率法和种子萌发法测定了茄链格孢毒素的抑菌和除草活性。结果表明:茄链格孢毒素对油菜菌核病菌、玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌均表现出较强的抑制活性,发酵液抑制率分别为73.0%、58.0%和84.5%;茄链格孢毒素对黑麦草种子的幼根幼芽生长表现出较强的抑制作用,在供试浓度下菌丝提取液的抑制率分别为53.3%,50.6%。

抗茄链格孢菌放线菌的筛选及鉴定

以茄链格孢菌为靶标菌,采用平板对峙法和生长速率法对分离自药用植物的221株放线菌进行筛选,通过生理生化特征、培养特征、形态特征和基于16S rRNA基因序列的相似性分析对活性菌株的种属进行了鉴定。结果表明,抑菌率75%以上放线菌有3株,其中菌株3150被鉴定为环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)的一个菌株,菌株3679被鉴定为氢化链霉菌(Streptomyces hydrogenans)的一个菌株,菌株4536被鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.)菌株。薄层色谱分析结果显示菌株3679代谢产物丰富且分离度好,进一步分离可望得到具有较好生防作用的化合物。

茄链格孢菌和马铃薯互作后期候选效应蛋白的筛选与鉴定

由茄链格孢菌(Alternaria solani)引起的马铃薯早疫病是马铃薯生产上的重要病害,严重影响马铃薯的产量和品质。为揭示A.solani与寄主马铃薯的互作机制,本研究利用RNA转录组测序技术和signalp-4.1、tmhmm-2.0c、phobius101和ProtComp v3等生物学软件,结合效应蛋白特征分析,筛选出A.solani与寄主马铃薯互作过程不同时期的效应蛋白,获得了137个差异表达的候选蛋白,并对其中4个候选蛋白(Gene03396、Gene06670、Gene02858和Gene06508)进行了进一步的分析和鉴定。RNA-seq结果显示,3个候选蛋白编码基因(Gene03396、Gene06670和Gene02858)在互作的3个时期(3、4和5 dpi)与无互作时(0 dpi)相比表达量总体呈现上升趋势,为上调表达模式;Gene06508的表达量呈现下降趋势,为下调表达模式。MEME在线软件分析发现这4个候选蛋白没有共同的基序(motif)。烟草过表达结果显示:Gene03396和Gene02858可直接诱导烟草细胞坏死,Gene06670可抑制由细胞凋亡促进基因BCL2-associated X(BAX)诱导的程序性细胞死亡(PCD)反应,表明效应蛋白是通过激发寄主免疫反应或抑制寄主防御反应来发挥作用。亚细胞定位发现Gene03396定位在细胞膜;Gene06670和Gene02858可能定位在细胞间隙。研究结果为进一步鉴定A.solani的效应分子以及揭示其致病分子机理提供了依据。

AsSlt2基因对茄链格孢细胞壁完整性的调控

【背景】由茄链格孢(Alternaria solani)引起的马铃薯早疫病被普遍认为是马铃薯生产上的第二大叶部病害,在马铃薯各产区普遍发生,给马铃薯生产造成了巨大的经济损失。【目的】明确AsSlt2基因对茄链格孢细胞壁完整性的影响。【方法】在含有刚果红、细胞壁降解酶和十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)等细胞壁胁迫的培养基上观察ΔAsSlt2缺失突变株的生长情况,计算相对生长抑制率;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测ΔAsSlt2菌株中细胞壁合成相关基因的表达情况;进一步检测ΔAsSlt2细胞壁中几丁质的含量及胞外酶活性。【结果】ΔAsSlt2缺失突变株对SDS、刚果红、细胞壁降解酶等细胞壁胁迫的敏感性增强,在加入细胞壁降解酶后突变株原生质体释放量显著增多;ΔAsSlt2对外源氧胁迫更敏感,突变株胞外过氧化物酶和漆酶活性均显著降低;进一步研究发现,ΔAsSlt2细胞壁中几丁质含量减少,几丁质合成相关基因与漆酶合成相关基因的表达量均明显降低。【结论】AsSlt2基因在茄链格孢细胞壁的完整性及抵御外界胁迫方面发挥重要作用。

李宝聚博士诊病手记(八十五) 芹菜链格孢叶斑病的鉴定与防治

芹菜尾孢叶斑病、链格孢叶斑病和斑枯病是芹菜叶部常见且发生严重的3种病害。但是,研究者对芹菜尾孢叶斑病和斑枯病研究较多,对芹菜链格孢叶斑病研究较少。芹菜链格孢叶斑病在中国、澳大利亚、加拿大、巴西、古巴、几内亚、丹麦和意大利均曾报道过。在中国,芹菜链格孢叶斑病最早于《中国真菌总汇》中记载,但至今未见详细报道。

抗番茄早疫病放线菌的筛选与防效研究

为了寻找番茄早疫病的微生物生防制剂,减少该病害对番茄产量与品质的影响.利用共培养法和菌丝生长抑制法从土壤中筛选番茄早疫病害的拮抗菌,并考察其抗菌谱、发酵液稳定性与防效效果.结果表明:成功筛选得到1株拮抗番茄早疫病较强的菌株Sa-6,菌丝生长抑制法显示该菌株发酵液对番茄早疫菌丝抑制率达60.27%;根据形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果,鉴定菌株Sa-6为微黄白链霉菌(Streptomyces albiflaviniger);其发酵滤液对杨树枯萎病菌、西瓜炭疽病菌等5种病原真菌及大豆细菌性斑点、水稻细菌性条斑等8种病原细菌均具有较好的抑制作用;同时菌株Sa-6发酵滤液对番茄早疫病的防效可达90%以上.因此,菌株微黄白链霉菌Sa-6有望为微生物生防制剂开发提供优良的菌种资源.

75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂对番茄早疫病的防效评价

番茄早疫病也叫做“轮纹病”,是番茄生产上的重要病害之一,是由茄链格孢菌侵染所致,在真菌分类中,属于半知菌亚门链格孢属。番茄早疫病不仅侵染叶片,还侵染果实、茎秆等部位,感染部位产生灰褐色病斑,造成叶片枯烂、果实干瘪、枝干断裂等。此病在全国各地均有发生,是对番茄产量造成巨大损失的重要病害。本次试验的目的在于通过田间药效试验。

番茄早疫病研究

在石河子不同地区采集到175个番茄轮纹斑,经在PDA培养基上进行单斑分离,不产孢者占77.4％,产孢者占22.6％。对不产孢菌株进行分生孢子诱发,以碳酸钙—蔗糖培养基(SA)最好,光照为其分生孢子形成中的最重要条件。经鉴定,不产孢菌株均为Alternaria solani,致病性很强,是主要致病菌;产孢菌株为A.tenuis,致病性较弱,可能为二次寄生菌。室内药剂筛选和田间药效测定,福美双和代森锰锌防治效果最好。田间药剂防治应在发病初期进行。

番茄早疫病病原菌鉴定及综合防治技术

番茄早疫病（Alternariaearlyblight）是由链格孢属（Alternaria）真菌引起的一种常发性世界病害,该病在美国、澳大利亚、以色列、印度、希腊等地发病率高,严重时可使番茄减产35%~78%（Vloutoglou＆Kalogerakis,2000）。自20世纪80年代以来,我国黑龙江、吉林、山东、河北、山西、广东、广西、湖北、江苏、上海、浙江、湖南和四川等大部分地区也普遍发生，危害年趋严重，成为露地、保护地番茄生产中的重要病害。

甘肃省番茄早疫病菌致病力测定及品种田间抗病性鉴定

从甘肃省河西番茄产区采集了36份番茄早疫病样品,共分离得到7个番茄早疫病分离物.经致病性测定,A1、A3、B和D4个分离物均可致病,且这4个分离物致病菌的分生孢子形态均为倒棍棒形,暗褐色,单生于分生孢子梗顶端,具纵隔膜0～5个,横膈膜5～12个,大小为(67～150.5)μm×(15.5～28.5)μm,喙长为(68.5～180.5)μm×(3.0～4.5)μm,根据其形态学特征鉴定为茄链格孢Alternaria solani(Ell&Mart) Sorauer.对39个供试品种(系)的田间抗病性鉴定结果表明:抗病品种(系)7个,.感病品种(系)30个,高抗品种(系)2个,感病材料占所有鉴定品种(系)的82.1%,抗病材料仅占17.9%.

加工番茄早疫病病原菌鉴定

为明确引起加工番茄早疫病的病原菌种类。2013年6-9月,从内蒙古、宁夏和新疆等加工番茄主产区采集了加工番茄早疫病样本46份。采用组织分离法,获得2种真菌分离物,通过形态特征观察、致病性测定、r DNA-ITS序列测定及分析,确定2种真菌分离物分别为茄链格孢和链格孢,分离比例约为2∶3。2种病原菌与Gen Bank中已有的茄链格孢和链格孢序列相似性均达到100%,序列已在Gen Bank上登录,登录号分别为KJ696551、KJ696552和KJ018786、KJ018787。因此,将内蒙古、宁夏和新疆等地的加工番茄早疫病菌鉴定为茄链格孢和链格孢,这是我国首次报道由2种链格孢菌复合侵染引起加工番茄早疫病。