红丽海棠茎尖超低温保存技术研究

【目的】建立红丽海棠超低温保存技术体系,实现其种质资源保存。【方法】以红丽海棠茎尖为试材,研究蔗糖预处理浓度和时间、装载处理时间、PVS2处理时间对其超低温保存后的存活率的影响,并在此基础上,在超低温保存程序中的不同环节添加3种抗氧化剂[过氧化氢酶(Catalase,CAT)、抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)]和2种细胞程序性死亡(PCD)抑制剂[(乙烯利Ethephon,Eth)和NO供体(Sodium Nitroprusside,SNP)],探讨其对茎尖冻后存活率的影响。【结果】(1)红丽海棠茎尖的玻璃化保存程序为:首先将红丽组培苗切为4~5 mm带顶芽茎段,接种在含0.7 mol·L^(-1)蔗糖的预培养基后放入4℃冰箱冷锻炼2 d;再将其切成约1.5~2.0 mm的茎尖,置于Loading溶液中,在室温下处理20 min,随后于0℃下PVS2溶液处理90 min,立即投入液氮冻存;需用时将其从液氮罐取出后,快速放入38℃水浴中化冻1 min,再用Unloading溶液在室温下震荡洗涤2次,每次10 min。采用此方法红丽海棠茎尖液氮冻后存活率为66.58%,恢复生长率为16.67%。(2)不同浓度的外源添加剂对红丽海棠冻后存活率影响不同。其中,CAT、AsA和GSH最佳添加浓度分别为200 U·ml^(-1)、400μmol·L^(-1)和0.04μmol·L^(-1),较对照冻后存活率分别提高了20.28%、6.75%和27.61%,添加Eth和SNP没有显示明显的正向作用。【结论】红丽海棠茎尖可以实现超低温保存,外源添加适宜浓度GSH、CAT、AsA可以提高液氮冻存后率,效果最好的GSH可将恢复生长率从16.67%提高到41.39%。

菊花茎尖外植体高效超低温保存技术建立的分析

菊花是全球最重要的鲜切花之一,建立高效的菊花茎尖超低温保存体系具有重要意义。本研究以菊花‘Sei Hillary’试管苗为材料,研究了茎尖大小、炼苗期光照条件、六种再生培养基配方、超低温保存方法、母株感染病害情况对超低温保存效率的影响,结果发现,上述参数均显著影响茎尖超低温保存效率,组织切片观察揭示了超低温保存方法影响再生效率的原因。本研究建立了一个高效的菊花茎尖超低温保存体系,主要技术步骤包括:健康试管苗在16 h的光周期下4℃炼苗6周、切取携带3~4片叶原基的茎尖(1.5 mm),利用小滴玻璃化法进行超低温保存,快速解冻后于添加0.05 mg/L GA3的1/2Knop培养基上再生培养。该体系可获得85.5%成活率和53.7%的再生率,为菊花种质资源提供了一种简单高效的长期保存方法。