茎瘤田菁在江苏沿海地区生长特性

茎瘤田菁(S.rostrata),又名毛萼田菁或具啄田菁,为豆科田菁属草本植物。它形态特征与普通田菁不同点是茎与分枝着生茎瘤能固氮。原产非洲,适宜在高温高湿环境中生长。80代年初从菲律宾引入我国。1987年以来我们对茎瘤田菁在江苏沿海地区的生长特性、固氮量、种子含胶品质等进行了试验研究,证实了它的茎瘤固氮率高。

根瘤菌对茎瘤芥的促生作用研究

[目的]研究田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染茎瘤芥的情况以及对植株促生作用的影响。[方法]分析根瘤菌对不同品种茎瘤芥的促生作用差异、不同浓度根瘤菌对茎瘤芥栽培品种“涪杂2号”的影响、不同诱导剂对结瘤的影响。[结果]田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染的6个茎瘤芥品种中,“涪杂2号”根长和株高增加显著,促生作用明显。以不同浓度田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染“涪杂2号”幼苗结果表明,在1.0×10^(8)个/mL浓度下,茎瘤芥的根长和株高增加最为显著,同时利用荧光显微镜观察到根瘤菌在“涪杂2号”健康幼苗根部组织的定殖情况,在处理茎瘤芥3 d后,根瘤菌可侵入茎瘤芥根部并定殖,在接菌15 d后,在茎瘤芥根系局部组织发展成很高的群体密度。横向比较3种诱导剂诱导茎瘤芥结瘤效率差异表明,使用2,4-D、氯磺隆、豆科威后,3种诱导剂均可在30 d后于茎瘤芥根部形成类根瘤,60 d后类根瘤数量明显增多,其中,2,4-D结瘤效率最好,高达93%,显著高于其他2种诱导剂结瘤效率。[结论]该研究为更好地利用根瘤菌促进茎瘤芥生长的共生体系打下基础。

田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦种子侵染的促生作用及其在根系内的定殖

选取8个常见小麦品种,通过室内限菌试验筛选出对于田菁茎瘤固氮根瘤菌Azorhizobium caulinodans ORS571(A.caulinodans)侵染响应敏感的品种,研究了浸种侵染、菌液浓度和添加葡萄糖对接菌小麦幼苗生长的影响,并结合荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)标记A.caulinodans在小麦幼苗根系内的分布与定殖规律。结果表明:小偃22为响应敏感品种;在室内限菌条件下,浸种侵染小偃22幼苗平均根长和平均株高分别较对照增加了17.04%和8.37%;最适菌液浓度为1.0×108个/mL;在菌液中添加1 g/L葡萄糖有助于A.caulinodans浸种侵染和定殖。荧光显微镜检测结果显示,GFP标记A.caulinodans从小麦幼苗根毛和侧根裂隙处进入,定殖于根维管组织等部位。田间试验结果进一步表明A.caulinodans浸种侵染对不同小麦品种均具较明显的促生作用。

田菁茎瘤固氮根瘤菌在小麦体内的定殖及营养元素相关miRNA的表达

【目的】随着化肥过度使用引起的环境问题的出现,无公害农业的推广,以及新型肥料研究领域不断拓宽,微生物肥料,尤其是植物根际促生菌的研究成为近年来的热点。然而微生物肥料的增产机理还基本停留在作物农学性状的表观调查上,没有从分子水平进行研究。因此,本文用田菁茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)侵染小麦,探索GFP-A.caulinodans在小麦幼苗组织中的分布与定殖规律以及营养元素相关miRNAs在小麦与A.caulinodans互作中的作用机制。【方法】使用A.caulinodans侵染小麦种子(品种为小偃22),将接菌6 d后的小麦幼苗的根和接菌12 d后的叶制作玻片,利用激光共聚焦显微镜对样品进行逐层扫描,检测GFP-A.caulinodans在幼苗不同组织中的分布与定殖情况。同时,采集接菌后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h的小麦幼根取样,用Trizol法提取总RNA。利用试剂盒进行加尾和反转录反应,将样品总RNA中的miRNA合成为cDNA,使用β-tubulin作为内参基因,进行实时定量PCR反应,使用2-ΔΔCT方法计算相对表达量。利用psRNATarget在线软件,采用默认参数,对miRNA的靶基因进行预测。【结果】1)激光共聚焦结果显示,GFP-A.caulinodans可定殖于根的表皮细胞、细胞间隙、根尖破损处和根毛,在根维管组织和叶片气孔部位,也发现有GFP-A.caulinodans存在。2)实时定量PCR分析结果表明,6条与营养元素代谢有关的miRNA表达发生变化,其中miR164、miR167和miR827相对表达量呈现出先上调后下调的趋势,miR169和miR398相对表达量也基本呈现出这一趋势。miR164、miR167、miR169和miR398的相对表达量在接菌12 h时上调至最高点,分别为对照的4.13、2.84、2.46和3.99倍;miR827相对表达量在接菌24 h时达到最高点,为对照的2.17倍。miR399相对表达量呈现出先下调后上调的趋势,在接菌24 h时降至最低点,为对照的0.21倍。3)通过靶基因预测,6条miRNA的靶基因分别编码了NAC1转录因子、生长素响应因子、HAP转录因子、Cu/Zn超氧化物歧化酶、蛋白缀合酶PHO2和SPX-MFS亚家族蛋白。【结论】GFP-A.caulinodans能够从根毛和根尖破损处等部位进入小麦幼苗根部定殖,并可通过向上迁移到达叶片,在气孔处定殖。接种A.caulinodans可不同程度增加小麦根中响应氮素、磷素、微量元素的miRNAs相对表达量,增强小麦幼苗对营养元素的吸收和利用,促进小麦根的形态建成。

田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦叶组织的促生作用研究

利用GFP标记的田菁茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans ORS 571）侵染露白24h的小麦种子,分别在侵染后0、6、12、24、48、72和96h采样,利用实时荧光定量PCR方法检测小麦体内6条与促生作用相关miRNAs（miR156、miR159、miR160、miR167、miR168和miR403）的表达模式,检测其中3条miRNAs（miR159、miR167和miR168）的靶基因表达模式;以接菌8d的小麦样品做切片,利用激光共聚焦显微镜检测小麦叶部田菁茎瘤固氮根瘤菌的分布,并测定小麦的生理指标。结果显示：（1）田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染小麦后能够在叶片边缘部位定殖。（2）小麦叶片中与促生作用相关的6条miRNAs出现了不同程度变化,在12~24h到达其峰值,随后逐渐下降,其中miR159在峰值时的表达量为初始表达量的2.88倍。（3）3条miRNAs的靶基因表达模式与相应miRNA表达模式相对应,但并不严格。（4）生理指标测定结果显示,接种田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦叶片产生明显的促生作用,其中叶鲜重在96h的变化与对照差异极显著。研究表明,接种的田菁茎瘤固氮根瘤菌能够到达小麦叶组织,对小麦叶片的生长产生明显的促生作用,其中miRNAs在促生过程中发挥重要作用。

田菁茎瘤固氮根瘤菌对穿心莲植株生长和有效成分含量的影响

目的:研究田菁茎瘤固氮根瘤菌对不施肥条件下穿心莲植株生长及其有效成分含量的影响。方法:用对数期的田菁茎瘤固氮根瘤菌菌液浇灌萌发结束的穿心莲幼苗,对照组用无菌水代替;第100天,对开花株数进行计数;测量其株高、叶片数、分枝数;采收穿心莲植株,测量其根长、地上部分和地下部分的鲜重和干重,每个处理组分为根、茎、叶和地上部分,测定其有效成分(穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯)含量。结果:田菁茎瘤固氮根瘤菌处理后,10~7个/mL浓度处理组对穿心莲植株生长和有效成分积累的促进效果最明显;该处理组开花株数是对照组的3.5倍;株高、分枝数、叶片数分别较对照组提高13.40%、16.75%、57.73%;地上部分鲜重、地上部分干重分别较对照组提高60.80%、67.08%;地下部分鲜重、地下部分干重分别较对照组提高24.40%、14.75%;地上部分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的总量较对照组提高16.16%。结论:田菁茎瘤固氮根瘤菌处理可促进穿心莲植株的生长并提高穿心莲有效成分含量。

毛萼田菁茎瘤菌共生状态下吸氢与固氮关系的研究

不同瘤龄、不同光照和生长周期的毛萼田菁，其茎瘤的吸氢活性和固氮活性均呈正相关。绿色的茎瘤，无论在数量上还是固氮及吸氢活性上均为最高。Ａ．ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓＯＲＳ５７１菌（Ｈｕｐ＋）、Ｈｕｐ－突变株和含Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ５．９ｋｂｈｕｐ结构基因质粒的转移接合子回接实验的结果表明，Ａ．ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ具吸氢活性的菌株对植株生长有益，茎瘤的固氮活性高于根瘤的２倍以上；吸氢活性亦高。转移接合子在无选择压力的条件下连续培养，其带有外源ｈｕｐ基因片段的质粒会缓慢丢失，最终从茎瘤中分离的Ｒ－３０９１１和Ｒ－４９１１已经完全丧失了Ｔｃ抗性。

毛萼田菁茎瘤菌吸氢酶基因克隆的研究

采用强迫克隆的方法，构建含Ａ．ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ５～７ｋｂＥｃｏＲⅠ酶切片段的质粒库，以Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ的ｈｕｐ结构基因为探针，经原位杂交，筛选到带有Ａ．ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ６．０ｋｂＥｃｏＲⅠ酶切片段的阳性克隆。经三亲本杂交，将阳性克隆转入Ａ．ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓＨｕｐ－突变株中，所得转移接合子的吸氢酶和固氮酶活性均未恢复，表明所克隆到的基因虽与Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ的ｈｕｐ结构基因同源，却不是一个能完整表达吸氢酶活性的功能单位。

毛萼田菁茎瘤菌(Azorhizobium caulinodans)吸氢活性缺陷株的筛选及特性

利用转座子Tn5随机插入突变法，从毛萼田菁茎瘤菌（Azorhizobiumcaulinodans）中筛选得到两株吸氢活性缺陷突变株（Hup-）R－49和R－309，其固氮酶活性也大大降低，约为野生型固氮酶活性的6％～8％。以带有Bradyrhizobiumjaponicum的5．9kb的hup基因的质粒pHR11为探针与A．caulinodansORS571和B.japonicum122DES（Hup＋）的总DNA进行分子杂交，放射自显影表明，A．coulinodans基因组含有与B.japonicum的hup基因同源的DNA片段，将携带B．japonicumhup基因的嵌合质粒pHR11与A.caulinodansHup-突变株进行体内遗传互补，接合转移子吸氢酶活性可以恢复至野生型的60％，同时固氮酶的活性亦有所提高。

绿黄隆诱发小麦结瘤与固氮初步探讨

用２．５ｍｇ／ｋｇ的绿黄隆＋１ｍｇ／ｋｇ的萘乙酸复会处理２－３叶期小麦根，即能诱导小麦结瘤，且植株生长正常，明显优于用１ｍｇ／ｋｇ２．４－Ｄ处理的小麦。同时接种田菁茎瘤菌（ＡｚｏｚｈｉｚｏｂｉｕｍＣａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）后电镜超薄切片看到形成含菌细胞，用乙炔还原法测定这些瘤状物能显示一定固氮活性。

毛萼田菁茎瘤菌被种子浸提物诱导表达基因的筛选及其功能

【目的】选择毛萼田菁茎瘤菌ORS571为研究对象,筛选毛萼田菁茎瘤菌在菌植互作早期被宿主植物种子浸提物诱导表达的基因。【方法】采用新颖的基于抗性的活体表达筛选技术,以种子浸提物为诱导物,筛选获得能够稳定被种子浸提物诱导的突变株。通过中间片断融合报告基因的方法研究信号分子对相关基因的诱导情况。【结果】随机引物PCR产物测序及网上BLAST结果表明,被诱导表达的基因为LysE家族的成员。而且,对另外3个属根瘤菌中lysE基因的研究发现,它们都可以被相应的宿主植物种子浸提物诱导表达。此外,这四株根瘤菌的lysE突变株都表现对刀豆氨酸极为敏感。本文首次报道了lysE家族在根瘤菌中的生理功能。【结论】我们推测:LysE家族蛋白可能广泛存在于根瘤菌中,并在根瘤菌与宿主植物的早期相互作用中发挥重要作用。