茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的作用机制

目的探讨茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治疗大鼠急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)的作用机制。方法选取雄性SPF大鼠5只,制备BMSCs;选取SD大鼠60只,随机分为正常组、模型组、对照组、中药组、干细胞组、联合组。以D-氨基半乳糖与脂多糖制备急性肝衰竭大鼠模型。各组采取相应的BMSCs悬液、生理盐水注入腹腔和胃部。造模成功后,检测各组生化指标、病理变化、凋亡相关蛋白及炎症因子的表达。结果茵陈四苓颗粒联合BMSCs可降低血清中的AST、ALT、TBIL,抑制TNF-α、IL-β、IL-6的表达。此外,两者还能降低Cyt-C、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达,抑制线粒体凋亡途径的激活,从而减少肝细胞的凋亡。结论茵陈四苓颗粒和BMSCs具有协同作用,两者联合能够减轻炎症反应,减少凋亡蛋白的表达,促进肝组织再生,其机制可能与抑制细胞凋亡和炎症信号通路有关。

茵陈四苓颗粒质量标准研究

目的建立茵陈四苓颗粒（赤芍、栀子、茵陈、大黄等）的质量标准。方法采用薄层色谱法对茵陈四苓颗粒中茵陈和大黄进行定性鉴别；采用HPLC法测定茵陈四苓颗粒中芍药苷、栀子苷、大黄素和大黄酚的量。结果薄层色谱斑点清晰、分离效果较好、且阴性无干扰。芍药苷在0．458-3．66μg范围内呈良好的线性关系（r=0．9998），平均回收率为97．75％，RSD为1．13％；栀子苷在0．65～5．2μg范围内呈良好的线性关系（r=0．9998），平均回收率为98．27％，RSD为1．08％；大黄素在0．0015-0．015I,xg范围内呈良好的线性关系（r=0．9999），平均回收率为98．04％，RSD为0．68％；大黄酚在0．0028～0．028μg范围内呈良好的线性关系（r=0．9998），平均回收率为98．83％，RSD为1．38％。结论该方法准确可靠、专属性强、重复性好，可以作为控制茵陈四苓颗粒质量的有效方法。

正交试验法优选茵陈四苓颗粒水提工艺

目的:优选茵陈四苓颗粒的最佳水提工艺。方法:采用正交试验法,以水提物的干浸膏重量、芍药苷的含量为综合评分指标,优选茵陈四苓颗粒的最佳水提工艺。结果:茵陈四苓颗粒最佳水提取工艺为:浸泡1.5h,加12倍量水,煎煮3次,每次1h。结论:该提取工艺客观可行,稳定合理,可为工艺生产提供理论依据。

茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠NF-κB、iNOS及TNF-α的影响研究

目的探讨茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对急性肝衰竭大鼠炎症介质谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、内毒素(ET)及相关通路核因子-κB(NF-κB)、i NOS及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。方法 1)全骨髓贴壁法制备大鼠BMSCs并体外培养;2)取清洁级雄性大鼠60只,随机分为正常组、模型组、阳性对照组、中药组、干细胞组、中药及干细胞联合组。除正常组外其余各组予以硫代乙酰胺灌胃造模;3)造模后中药组及联合组每日予以茵陈四苓颗粒灌胃;干细胞组及联合组予以尾静脉注射干细胞悬液。72 h后处死大鼠,收集血标本,检测肝脏ALT、AST及血浆ET水平,制作病理切片,免疫组化检测NF-κB表达,RT-PCR检测TNF-α、i NOS的基因转录。结果造模后各治疗组肝脏生化、TNF-α、i NOS的基因转录水平、NF-κB的细胞数目较模型组明显降低(P <0.05),肝脏组织坏死程度减轻,可见部分增生肝细胞,炎性浸润减轻。其中以联合组效果最佳(P <0.05)。结论茵陈四苓颗粒联合BMSCs治疗,可减轻急性肝衰竭大鼠肝损伤,有效抑制肝脏炎症反应,对急性肝衰竭有一定治疗作用。

茵陈四苓颗粒对胆汁淤积性肝炎大鼠肝功能损害的改善作用及其机制研究

目的探讨茵陈四苓颗粒对胆汁淤积性肝炎大鼠肝功能损害的改善作用及可能的机制。方法将30只SD大鼠随机分为对照组、模型组和茵陈四苓颗粒干预组,采用α-异硫氰酸萘酯(ANIT)灌胃法制备胆汁淤积性肝炎大鼠模型。采用RT-PCR法检测肝组织白介素-17(IL-17)、干扰素-γ(IFN-γ)、超氧化物歧化酶(SOD)和法尼酯X受体(FXR)mRNA水平。结果茵陈四苓颗粒干预组动物血清ALP和GGT水平分别为(254.3±16.4)U/L和(14.3±5.8)U/L,显著低于模型组【分别为(625.8±36.5)U/L和(26.7±7.9)U/L,P<0.05】;血清IL-17、IFN-γ和丙二醛水平分别为(162.2±16.4)pg/ml、(28.9±6.2)pg/ml和(19.2±3.8)U/ml,显著低于模型组【分别为(223.4±18.8)pg/ml、(39.3±9.8)pg/ml、(28.6±2.4)U/ml,P<0.05】,而血清SOD水平为(324.1±33.5)U/ml,显著高于模型组【(250.8±25.4)U/ml,P<0.05】;茵陈四苓颗粒干预组肝组织IL-17和IFN-γmRNA水平为(2.1±0.3)和(17.3±3.5),显著低于模型组【分别为(3.4±0.5)和(34.5±7.2),P<0.05】,而SOD和FXR mRNA水平为(0.8±0.4)和(2.2±0.5),显著高于模型组【分别为(0.3±0.2)和(1.5±1.1),P<0.05】。结论茵陈四苓颗粒能明显改善胆汁淤积性肝炎大鼠肝组织损伤,其机制可能与调控IL-17、IFN-γ和MDA等因子水平,降低炎症反应和提高抗氧化能力有关。

茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝脏线粒体呼吸链复合物和ATP活性的影响研究

目的研究茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植(BMSCs)对急性肝衰竭大鼠肝脏线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及三磷酸腺苷ATP活性的影响。方法(1)选择全骨髓贴壁法提取大鼠BMSCs进行体外培养并鉴定。(2)随机将60只SD雄性大鼠等分为正常组、模型组、阳性对照组(复方甘草酸苷片干预)、中药组(茵陈四苓颗粒干预)、干细胞组(BMSCs移植干预)、联合组(中药联合干细胞移植干预)。(3)采用腹腔注射硫代乙酰胺建立急性肝衰竭大鼠模型,造模成功后各组分别予相应药物干预,干细胞组及联合组尾静脉注射MSCs悬液进行干预。(4)干预72 h后收集血清及标本,检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)生化水平,HE染色观察大鼠肝组织病理形态变化,透射电子显微镜(TEM)观察肝细胞线粒体超微结构变化,测定线粒体总蛋白、呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ酶活性变化,用磷钼酸比色法检测ATP含量,Western-blot检测Bcl-2、Caspase-3的表达。结果与模型组相比,各干预组大鼠肝细胞和肝线粒体变性坏死、炎细胞浸润得到改善;肝脏生化和Caspase-3蛋白水平降低,Bcl-2蛋白表达升高,大鼠肝脏线粒体提取液中ATP浓度升高,复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活力升高(P<0.05),其中联合组最佳(P<0.05)。结论茵陈四苓颗粒联合BMSCs可以通过提高ATP活性,增强呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活力,改善线粒体能量代谢、抑制线粒体损伤而对急性肝衰竭有一定作用。

茵陈四苓颗粒联合脂肪间充质干细胞移植治疗对急性肝衰竭大鼠TNF-α及HGF、VEGF的影响研究

目的探讨茵陈四苓颗粒联合脂肪间充质干细胞(ADSCs)移植对急性肝衰竭大鼠肝功能ALT、AST、TBIL,炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法将60只雄鼠随机等分为A正常组、B模型组、C阳性对照组、D中药组、E脂肪间充质干细胞组、F联合组。除正常组外其余各组造模;造模成功后D组及F组每日灌胃茵陈四苓颗粒;E组及F组予以尾静脉注射ADSCs悬液。48h后处死大鼠,收集标本,苏木精-伊红染色观察肝脏病理形态学变化;生化检测血清中肝功能ALT、AST、TBIL;ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及生长因子HGF、VEGF水平。结果造模后各治疗组肝功能ALT、AST、TBIL及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平较模型组明显降低(P<0.05),生长因子HGF、VEGF与模型组比较明显升高(P<0.05),肝组织切片坏死程度好转,炎性浸润减轻;其中联合组效果最佳(P<0.05)。结论茵陈四苓颗粒联合ADSCs治疗急性肝衰竭大鼠,可以明显缓解急性肝衰竭大鼠的肝损伤,有效减轻肝脏炎症反应,促进肝细胞的再生及血管生成,对急性肝衰竭有一定治疗作用。

茵陈四苓颗粒对急性肝衰竭大鼠肠屏障功能的影响

目的研究茵陈四苓颗粒对急性肝衰竭大鼠模型肠屏障功能的影响。方法将40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(双歧杆菌乳杆菌三联活菌片干预)、中药组(茵陈四苓颗粒干预),予以腹腔注射硫代乙酰胺建立急性肝衰竭大鼠模型,并予以相应药物干预。造模成功48 h后收集腹主动脉血检测大鼠血清AST、ALT、TBIL,HE染色观察大鼠肝肠组织病理,ELISA法测血清DAO、D-LA及炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)水平,Western blot检测Occludin及ZO-1蛋白的表达。结果茵陈四苓颗粒可以减缓大鼠体质量下降,抑制AST、ALT、TBIL的升高(P<0.05),降低血清DAO、D-LA及炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α的表达(P<0.05),促进肠组织中Occludin蛋白、ZO-1蛋白的表达(P<0.05)。结论茵陈四苓颗粒可以通过保护急性肝衰竭大鼠肠屏障功能障碍,减轻肠源性内毒素血症,促进肝脏修复。

茵陈四苓颗粒乙醇提取工艺优选

目的:优选茵陈四苓颗粒的乙醇提取工艺。方法:以栀子苷提取量为指标,通过单因素试验比较乙醇回流法、乙醇超声法和乙醇渗漉法,确定茵陈四苓颗粒中部分药材的提取方法;通过正交试验考察乙醇体积分数、浸泡时间、加醇量、渗漉流速对提取工艺的影响。采用HPLC测定栀子苷含量,色谱条件为UltimateTMC18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-水(15∶85),流速1 mL·min-1,柱温40℃,检测波长238 nm,进样量10μL。结果:采用乙醇渗漉法提取,最佳提取工艺条件为加10倍量70%乙醇浸泡12 h,渗漉流速5 mL·min-1,栀子苷提取量达42.524 4 mg·g-1。结论:该工艺客观可行、稳定合理,可为茵陈四苓颗粒的工业生产提供理论依据。

茵陈四苓颗粒对肝衰竭环境下骨髓间充质干细胞分化及IDO蛋白表达的影响

目的:研究肝衰竭体外模型环境下茵陈四苓颗粒对骨髓间充质干细胞的肝向分化及IDO蛋白表达的影响。方法:通过建立肝衰竭血清、中药干预血清、健康血清分别与骨髓间充质干细胞(BMSCs)共培养体系,检测BMSCs中CK18免疫荧光表达,Western-blot法检测甲胎蛋白(AFP)、肝组织白蛋白(ALB)、吲哚胺2,3—双加氧酶(IDO)蛋白表达。结果:1、CK18免疫荧光结果显示肝衰竭组及中药干预组染色均为弱阳性,但后者染色更强,而健康组无阳性染色;2、AFP、ALB在健康组、肝衰竭组、中药干预组均有表达,且各组间ALB比较均有差异(P<0.05),三组AFP表达水平逐渐增高,各组间差异有统计学意义。IDO蛋白在健康组无表达,肝衰竭组表达低于中药干预组,且两组间差异具有统计学意义。结论:茵陈四苓颗粒能增强BMSCs在肝衰竭环境下的肝向分化趋势及免疫调节活性。

茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠线粒体膜电位的调节作用研究

目的:观察茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)对急性肝衰竭大鼠线粒体膜电位的调节作用。方法:将60只雄性SPF级SD大鼠随机分成A组(正常组)、B组(茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞组)、C组(茵陈四苓颗粒组)、D组(模型组)、E组(复方甘草酸苷组)、F组(骨髓间充质干细胞组),每组各10只。采用硫代乙酰胺腹腔注射的方法制备急性肝衰竭大鼠模型,进行BMSCs的分离纯化、培养及鉴定,观察大鼠的一般情况与存活情况,血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBil)的含量,肝脏组织病理情况、肝线粒体的形态与结构、肝线粒体膜电位。结果:大鼠血清ALT、AST、TBil水平比较,D组较A组明显升高(P<0.05),B、C、E、F组较D组降低,其中B组降低更显著,差异均有统计学意义(P<0.05),E、F组组间差异无统计学意义(P>0.05)。B、C、E、F组肝脏组织病理、线粒体形态与结构的变化情况较D组好转。D组Q1-UR/Q1-LR阳性百分比比值显著升高,与A组比较,差异有统计学意义(P<0.05);B、C组与D组比较,差异有统计学意义(P<0.05);各干预组肝线粒体膜电位稳定,E组<F组<C组<B组,组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠线粒体膜电位发挥调节作用,并通过抑制线粒体凋亡来改善急性肝衰竭,保护肝细胞。