山核桃茶藨子葡萄座腔菌全基因组的分泌蛋白预测和功能分析

茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea是一种世界性分布真菌,能引起山核桃干腐病,导致严重经济损失。为研究该病害的致病机理及筛选致病基因,通过各类预测与分析工具,对13130条蛋白序列的山核桃Carya cathayensis茶藨子葡萄座腔菌BDLA16-7全基因组进行了分泌蛋白预测及其功能分析。结果表明,在BDLA16-7全基因组的编码蛋白序列中,有898条蛋白序列符合典型分泌蛋白的特征,占总蛋白数的6.84%;分泌蛋白组的氨基酸组成呈现以下特征:非极性、疏水性氨基酸的含量明显高于极性、亲水性氨基酸,分别占43.6%和27.7%;蛋白质长度主要分布在100至600个氨基酸之间;分泌蛋白序列中通常以19个氨基酸构成信号肽,丙氨酸(A)是最常见的非极性氨基酸,而带电侧链的天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的出现频率较低;信号肽的切割位点-3和-1位置上的氨基酸相对保守,典型的氨基酸组合为A-S-A,符合A-X-A型的特征。此外,分泌蛋白组中包含600个序列可以完整注释其功能,其中229个分泌蛋白主要涉及碳水化合物的运输和代谢。在BDLA16-7分泌蛋白组中,共存在271个潜在的效应蛋白,其中14个与其他病原菌致病相关的效应蛋白具有较高的相似性。此外,BDLA16-7分泌蛋白组中包含293个碳水化合物活性酶,以糖苷水解酶家族成员为最多。明确了茶藨子葡萄座腔菌BDLA16-7分泌蛋白的长度分布特征,功能分类、信号肽切割位点的氨基酸组成、切割位点的类型和CAZymes数目,以及CAZymes中纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶的亚家族组成,并筛选到14个与致病性紧密联系的潜在效应蛋白。

四霉素对茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria ribis室内毒力测定及其田间防效试验

为确定四霉素对杨树溃疡病的防治效果,采用菌丝生长速率法测定四霉素水剂对茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria ribis的室内毒力,采用刮治喷涂法对茶藨子葡萄座腔菌引起的杨树溃疡病进行田间应用效果研究。试验结果表明,四霉素对茶藨子葡萄座腔菌的EC50和EC90分别为114.82 a.i.mg/L、389.05 a.i.mg/L,对茶藨子葡萄座腔菌具有较好的抑菌效果,优于对照药剂多抗霉素。田间防效试验结果表明,刮治喷涂0.3%四霉素水剂可以有效防治真菌病原茶藨子葡萄座腔菌导致的杨树溃疡病,其有效成分浓度为60~150 a.i.mg/L时,田间防效达68.25%~82.41%,与室内毒力测定结果相符。

树木溃疡病菌主要类群系统地位及茶藨子葡萄座腔菌的种内一致性

报道利用微卫星引物[(GT)n、(CGA)n、(CCA)n、(GAA)n、(CAA)n、(GA)n]和小卫星引物M13进行的葡萄座腔菌属、盾壳霉属和疡壳孢属真菌的随机扩增微卫星多态性PCR(RAMs_PCR)遗传多样性结果:42个参试菌株被分为4个RAMs分类群;其中22个葡萄座腔菌属菌株和6个小穴壳菌属菌株分布于这4个类群中;RAMs分类群Ⅰ,Ⅱ,IV仅仅由葡萄座腔菌属和小穴壳菌属菌株构成,部分茶子葡萄座腔菌,4个贝伦格葡萄座腔菌和所有的盾壳霉属和疡壳孢属菌株构成了RAMs分类群Ⅲ。研究结果显示通过形态学确定的茶藨子葡萄座腔菌种内具有遗传不一致性,形态学上一致的28个茶子葡萄座腔菌菌株识别为4个不同的表观群;造成苹果轮纹病菌和苹果干腐病菌的贝伦格葡萄座腔菌菌株与部分茶子葡萄座腔菌在分子水平上非常相似;研究结果亦显示盾壳霉属与疡壳孢属真菌有着较近的系统关系。

山核桃干腐病病原菌的鉴定

葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌是很多木本植物溃疡病和枯梢病的重要病原菌。已有报道认为:山核桃干腐病病原菌为茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea,但对于葡萄座腔菌科其他真菌与山核桃干腐病的关系还没有深入研究。分离得到了山核桃干腐病相关病原菌,通过比较其形态学特征和核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)序列特征,将分离得到的供试菌株分为3组。根据形态学特征和基于ITS序列的系统发育分析,3组菌株分别鉴定为Botryosphaeria dothidea,B.fabicercianum和B.obtusa。其中B.dothidea为优势菌株,分离频率为71.42%,B.fabicercianum和B.obtusa分离频率分别为14.28%。经致病性测定,上述分离菌株均能引起健康山核桃Carya cathayensis枝条发病,但致病性存在差异。在山核桃上发现的B.obtusa和B.fabicercianum为首次报道。

泡核桃干腐病病原菌分离鉴定及杀菌剂室内筛选

为明确泡核桃干腐病的病原和筛选合适的化学防治药剂,从云南省楚雄州大姚县核桃病害标本中分离和鉴定了病原菌,测定了8种杀菌剂的毒力。通过柯赫氏法则验证,确定分离得到的该菌株能侵染泡核桃,产生干腐症状。依据形态特征和r DNA-ITS序列分析,将病原鉴定为茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。室内毒力测定的结果表明:8种杀菌剂的EC50从大到小依次为氟啶胺0.060 4 mg/L、戊唑醇0.169 0 mg/L、苯醚甲环唑0.177 8 mg/L、嘧菌酯0.476 9 mg/L、福美双2.094 7 mg/L、噻呋酰胺3.961 0 mg/L、异菌脲4.219 0 mg/L、霜脲氰101.764 3 mg/L。

山核桃干腐病菌环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测体系的建立

为了建立一种能够快速、准确、高效地检测山核桃干腐病菌的技术,本研究根据茶藨子葡萄座腔菌的β-tubulin基因序列设计外引物、内引物和环引物,并对扩增体系和条件进行了优化、并分析其特异性和灵敏度。结果使用羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,反应体系(Bst DNA聚合酶0.16U/μL,外引物F3和B3均为0.2μmol/L,内引物FIP和BIP均为1.6μmol/L,环引物LB为0.8μmol/L,Mg^(2+)为4 mmol/L,dNTP为1mmol/L,甜菜碱Betaine为0.6mmol/L)在等温(64℃)条件下反应1h能特异性检测山核桃干腐病菌:以山核桃干腐病菌DNA为模板的反应液呈阳性(变为蓝色),而其余的病菌均为阴性(仍为紫色),该技术的最低检测限为1pg/μL。

大连地区雪松枝枯病(叶枯病)死亡现象调查及防治研究

2008年,辽宁省大连市经济开发区(现金普新区),在通往金石滩的主路中间绿化带上栽植了300余株大雪松,从第二年开始,这些雪松逐渐出现了枯头、枯枝、枯叶等现象,最终死亡,造成巨大经济损失的同时还给原产地和栽植地的生态造成了严重的破坏。2018年此种现象再一次出现在大连地区星海人家小区里的雪松上,经过整理大量科研资料以及实地考察确定该批雪松系感染子囊菌亚门的茶簏子葡萄座腔菌(Botro-sphaeria ribis)所引起的雪松枯枝病,亦称为雪松叶枯病。确认病情后,随即对现场的雪松展开救治,采取常规治疗措施的同时,还第一次投入了“那氏778”诱导剂灌根扶壮法,实验效果显著持久。

9种药剂防治山核桃干腐病试验研究

分别于2016年和2017年,采用林业施药试验测定了不同稀释倍数的30%苯甲·丙环唑乳油、32.5%苯甲·嘧菌酯悬浮剂、40%腈菌唑可湿性粉剂等9种不同农药对山核桃干腐病病斑复发和新病斑形成的影响,比较了凿破病斑和不凿破病斑对喷药的防治效果。结果表明:供试的9种药剂对山核桃干腐病病斑复发及新病斑发生均有显著的抑制效果;凿破病斑处理能显著提高药剂防治效果,2016年,30%苯甲·丙环唑乳油和50%喹啉铜可湿性粉剂防治后病斑复发率分别降低了57.52%和61.14%,新病斑发生率分别降低了36.19%和34.75%;2017年,处理后均无病斑复发和新病斑产生。