基于网络药理学、分子对接、分子动力学模拟探讨茸菖胶囊治疗小儿癫痫的靶点机制

[目的]笔者团队前期研究已证实茸菖胶囊治疗小儿癫痫(epilepsy)与雌激素水平、自噬过程、AMPK、mTOR信号通路有关,但暂无成份与靶点间的关系,研究将通过网络药理学、分子对接、分子动力学模拟的方法探讨茸菖胶囊多分子、多靶点、多通路的作用机制,为其基础及临床研究提供参考。[方法]通过TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM及文献检索筛选出茸菖胶囊的生物活性成分及靶点,通过GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库检索疾病靶点信息并取药物、疾病的交集靶点;使用String数据库获得蛋白相互作用关系,并利用Cytoscape软件构建药物-活性成分-靶点图以及药物-靶点-KEGG网络关系图;利用AutoDockTools、Vina软件进行分子对接;利用Gromacs软件对ESR1与柚皮素进行分子动力学模拟。[结果]茸菖胶囊中共筛选出117个活性成份,115个药物疾病交集靶点,通过CytoNCA插件筛选出18个核心靶点;GO分析表明,主要涉及类固醇代谢过程、对金属离子的反应等;KEGG分析表明,主要涉及脂质和动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路等;分子对接结果显示30对组合Affinity值均≤-5 kcal/mol;分子动力学模拟中RMSD及ROG数值波动较小,RMSF中Res 307-350,Res 525-551数值较大。[结论]通过网络药理学预测了茸菖胶囊治疗癫痫的潜在作用机制,主要通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等分子涉及AKT1、TNF、IL-6等靶点,作用于脂质和动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路、白介素-17信号通路等干预癫痫,这些通路与神经炎症及氧化应激关系最为密切,且预测了前期研究通路中的药物-靶点关系;分子对接结果表明,排名前5的分子与排名前6的靶点结合较紧密;分子动力学模拟结果表明ESR1与柚皮素结合稳定且紧密,提示调节雌激素水平可能是茸菖胶囊治疗癫痫的潜在作用机制之一。

茸菖胶囊对幼年大鼠癫痫后NRSF和BDNF蛋白表达的影响

[目的]研究茸菖胶囊对幼年大鼠癫痫后神经元限制性沉默因子(NRSF)和脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达的影响。[方法]建立戊四唑点燃癫痫模型,分为中药高、中、低剂量组、西药组、模型组和空白组,用蛋白免疫印迹杂交法检测各组NRSF和BDNF蛋白的变化。[结果]幼年大鼠致痫后模型组海马NRSF和BDNF蛋白表达升高,中药高剂量组可显著降低大鼠海马齿状回NRSF和BDNF蛋白表达(P<0.01),作用优于西药组和其他中药组。[结论]中药复方茸菖胶囊抗癫痫及改善癫痫后认知障碍机制可能与调控组蛋白乙酰化修饰及其所介导的神经元基因表达有关。

茸菖胶囊预处理对致痫大鼠血脑屏障超微结构及闭锁蛋白-5的影响

目的观察茸菖胶囊预处理对癫痫大鼠血脑屏障(BBB)超微结构及闭锁蛋白-5(claudin-5)的影响。方法将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、西药组、中药低剂量预处理组(中低组)、中药中剂量预处理组(中中组)和中药高剂量预处理组(中高组) 6组,每组10只。采用PTZ慢性点燃动物模型,茸菖胶囊预处理即采用造模同时分别予以各组相应的中西药药液预处理干预,预处理剂量分别为治疗量的1/2,2次/d,1次/d,连续28 d。预处理后各组均予相应治疗量继续治疗28 d。电镜观察各组大鼠海马BBB超微结构,伊文思蓝(EB)法观察海马BBB通透性及免疫组化法测定claudin-5表达。结果电镜下中药各组大鼠海马BBB超微结构损伤程度均低于模型组,中药各组和西药组海马EB浓度均低于模型组(P<0.05);中药各组大鼠海马EB浓度表达与西药组比较,差异无统计学意义(P>0.05);中药各组和西药组大鼠海马claudin-5表达均低于模型组(P<0.05),中低组大鼠海马claudin-5表达低于西药组(P<0.05),中中组和中高组与西药组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。推测从而达到改善癫痫大鼠认知功能的作用。结论通过茸菖胶囊预处给药的方法,可能通过降低claudin-5蛋白表达修复海马BBB超微结构,改善海马记忆功能。

茸菖胶囊对戊四唑点燃模型大鼠海马BDNF及其受体TrkB表达的影响

[目的]阐明脑源性神经营养因子(BDNF)及其功能受体酷氨酸激酶B(TrkB)在癫痫后认知障碍中的作用以及茸菖胶囊对海马脑源性神经营养因子及其受体TrkB的远期影响。[方法]以戊四唑点燃大鼠为模型,随机分为中药组、西药组、模型组和正常组,观察致痫大鼠的惊厥发作次数、级别、潜伏期,采用RT-PCR检测BDNF和TrkB基因表达水平。[结果]各治疗组大鼠与治疗前相比,均可减少大鼠的发作程度,治疗前造模各组的发作次数无统计学差异(P>0.05),茸菖胶囊治疗后,治疗大鼠的发作评分明显下降,与模型组相比,各治疗组的发作评分较低(P<0.05),茸菖胶囊组与丙戊酸钠组的评分无统计学差异(P>0.05)。各组海马组织BDNF mRNA表达显示,模型组海马组织BDNFmRNA表达较正常组、中药组和VPA组明显增多,中药组表达较其他各组增多均有统计学差异(P<0.01)。海马组织TrkB mRNA表达与BDNF mRNA表达趋势相同。[结论]茸菖胶囊可以有效控制癫痫大鼠的发作次数及级别,其作用机制与调控海马组织中BDNF、TrkB mRNA的表达有关。

茸菖胶囊对戊四唑致痫大鼠学习记忆能力及海马苔藓纤维出芽的影响

[目的]观察茸菖胶囊对戊四唑致癫痫大鼠学习记忆能力及海马组织苔藓纤维发芽(MFS)的影响。[方法]以戊四唑点燃大鼠为模型,随机分为中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、丙戊酸钠组、模型组、正常组,水迷宫实验记录逃避潜伏期和跨越平台次数,戊四唑惊厥阈实验测定惊厥潜伏期,Timm染色法观察海马苔鲜纤维出芽。[结果]各治疗组大鼠与治疗前相比,均可减少大鼠的发作程度,水迷宫实验:中药组逃避潜伏期和跨越平台次数均明显短于模型组(P>0.05)。Timm染色结果表明:各治疗组海马CA3区及齿状回分子层Timm染色颗粒MFS评分低于模型组(P<0.01)。[结论]茸菖胶囊可以有效控制癫痫大鼠的发作次数及级别,改善戊四唑致癫痫大鼠的学习记忆能力,其作用机制与抑制海葬纤维异常出芽,从而保护海马神经元有关。

茸菖胶囊对无镁癫痫细胞模型海马神经元形态及存活状态的影响

目的观察以益肾填精法为主的茸菖胶囊对无镁诱导的癫痫细胞模型海马神经元形态及存活状态的影响,探讨其对损伤神经元的保护作用及机制。方法原代培养新生SD大鼠海马神经元,建立无镁诱导的癫痫细胞模型,随机分为正常组(正常细胞外液)、模型组(无镁细胞外液)、对照组(无镁+3-甲基腺嘌呤)和5%、10%、20%茸菖胶囊组(无镁+不同浓度茸菖胶囊),采用倒置相差显微镜观察各组神经元形态学变化及凋亡情况,检测海马神经元活性及海马神经元损伤程度。结果 (1)形态学变化:各时间点不同浓度茸菖胶囊组细胞较模型组海马神经元形态损伤减轻,胞体较完整,突起较清楚,存活细胞量多;(2)海马神经元活性:与正常组比较,模型组海马神经元细胞活力显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,5%、10%、20%茸菖胶囊组显著提高无镁诱导的海马神经元的细胞活力,差异有统计学意义(P<0.05);(3)海马神经元损伤程度:与模型组比较,5%、10%、20%茸菖胶囊组可显著减少无镁诱导所致的海马神经元内乳酸脱氢酶释放量,差异有统计学意义(P<0.05),并具有浓度依赖性;与正常组比较,模型组海马神经元乳酸脱氢酶释放量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);5%、10%、20%茸菖胶囊组海马神经元内乳酸脱氢酶释放量随其浓度升高而逐渐降低。结论 (1)茸菖胶囊能降低无镁诱导的癫痫细胞模型海马神经元乳酸脱氢酶释放量,维持细胞膜的完整性及线粒体功能,提高细胞活力并降低海马神经元凋亡率,起到保护海马神经元的作用。(2)茸菖胶囊提高对无镁诱导癫痫细胞模型神经元的活性,抑制海马神经元的凋亡,其神经保护作用可能与调控神经元自噬有关。

茸菖胶囊对癫痫后认知障碍幼年大鼠神经发生的影响

目的观察茸菖胶囊对癫痫后认知障碍幼年大鼠学习记忆能力和神经发生的影响,探讨其治疗癫痫后认知障碍的可能机制。方法 102只SD大鼠随机分为正常组、模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、西药组。运用戊四唑点燃法复制癫痫大鼠模型,并经水迷宫实验筛选认知障碍大鼠。正常组不予处理,模型组予生理盐水灌胃,中药高、中、低剂量组分别予浓度为0.44g/ml、0.22g/ml、0.11g/ml茸菖胶囊溶液灌胃,西药组予40mg/ml德巴金溶液灌胃,每次3ml,每日2次,均给药28d。每组又分别于5-溴脱氧尿苷嘧啶(BrdU)标记后24h和28d取材。采用水迷宫实验于治疗前后观察大鼠逃避潜伏期和跨越平台次数;观察BrdU阳性细胞形态并计数进行BrdU免疫组化评分,计算新生神经细胞迁移比率(Br-dU/DCX)、新生神经细胞分化为神经元比率(BrdU/NeuN)和新生神经细胞分化为胶质细胞比率(BrdU/GFAP)。结果治疗后西药组和中药高、中剂量组大鼠逃避潜伏期较模型组缩短(P<0.05或P<0.01),并且中药高剂量组较中药中、低剂量组大鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05)。中药高剂量组大鼠跨越平台的次数显著高于模型组和中药低剂量组(P<0.05)。与模型组比较,24h时中药高剂量组、西药组和28d时中药高剂量组、中药中剂量组、西药组BrdU免疫组化评分显著减少(P<0.05或P<0.01)。西药组、中药高剂量组、中药中剂量组BrdU/DCX、BrdU/NeuN低于模型组(P<0.05或P<0.01);中药高剂量组BrdU/NeuN明显低于中药中、低剂量组(P<0.01);各组大鼠BrdU/GFAP比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论茸菖胶囊可改善癫痫后认知障碍大鼠学习记忆功能,其机制可能为抑制大鼠海马齿状回神经前体细胞增、异常迁移和分化。

熄风胶囊、茸菖胶囊、抗痫胶囊对海马神经元NMDA受体电流及细胞内游离钙的影响

目的:探讨中药复方(熄风胶囊、茸菖胶囊、抗痫胶囊)对海马神经元惊厥损伤的保护作用和作用机制。方法:将无镁诱导的海马神经元放电模型分为正常组、无镁组、MK801(地卓西平)组、抗痫胶囊组、茸菖胶囊组、熄风胶囊组,给予相应处理后6h、24h、72h,比较神经元放电频率、NMDA受体通道电流及细胞内游离[Ca^(2+)]i浓度。结果:放电频率:6h、24h各组较无镁组放电次数减少;72h MK801、抗痫组、熄风组较无镁组放电次数减少。NMDA受体通道电流:72h无镁组与正常组比较,通道电流增多;6h、72h抗痫组,72h茸菖组较无镁组通道电流减少。细胞内游离[Ca^(2+)]i浓度:三个时点无镁组Ca^(2+)浓度高于正常组;三个时点MK801组、熄风胶囊组,24h、72h抗痫胶囊组,72h茸菖胶囊组较无镁组Ca^(2+)浓度降低。结论:熄风胶囊、茸菖胶囊、抗痫胶囊可能通过减少NMDA受体通道电流,降低细胞内Ca^(2+)浓度,达到抑制海马神经元反复高频放电,减轻Ca^(2+)超载造成的细胞毒性,从而起到神经保护作用。

茸菖胶囊对雌性癫痫大鼠动情期雌激素及其受体的影响

目的:观察茸菖胶囊对雌性癫痫模型大鼠动情期雌激素及其受体的影响,探讨茸菖胶囊治疗月经性癫痫的作用机制。方法:选取动情周期规律的大鼠48只,分为正常组、模型组、丙戊酸钠组、拉莫三嗪组、茸菖低剂量组、茸菖高剂量组,每组8只。除正常组外,其余各组大鼠以戊四唑诱导癫痫模型。正常组不作处理;模型组灌服0.9%氯化钠溶液;丙戊酸钠组灌服丙戊酸钠(120mg·kg^(-1)·d^(-1))口服液;拉莫三嗪组灌服拉莫三嗪(12mg·kg^(-1)·d^(-1))药液;茸菖低、高剂量组灌服茸菖胶囊(1.65、3.30g·kg^(-1)·d^(-1))药液;持续灌药28d。后用阴道脱落细胞涂片法选出各组处于动情期大鼠,腹腔注射戊四唑,观察大鼠惊厥行为,酶联免疫吸附测定血清雌二醇(E_(2))、孕酮(P)水平,蛋白免疫印迹法检测海马雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)、N-甲基-D-天冬氨酸受体1(NR1)蛋白水平。结果:与正常组比较,模型组血清E;水平及海马ERα、ERβ、NR1蛋白均显著升高(P<0.01);与模型组比较,茸菖高剂量组惊厥潜伏期、强直阵挛潜伏期显著延长(P<0.05),血清E;水平及海马ERα、ERβ、NR1蛋白均显著下降(P<0.05,P<0.01)。结论:茸菖胶囊能够减轻雌性癫痫模型大鼠动情期惊厥发作,其机制可能与抑制血清雌激素水平和下调海马ERα、ERβ、NR1的表达有关。

茸菖胶囊预处理对致痫大鼠抗惊厥行为的影响

目的通过茸菖胶囊预处理干预戊四唑诱导癫痫大鼠抗惊厥行为的影响。方法将SD大鼠随机分正常组、模型组、丙戊酸钠组、茸菖胶囊组。模型组在腹腔注射前给予生理盐水灌胃,丙戊酸钠组和茸菖胶囊组亦在腹腔注射前给予预治疗量灌胃,随后进行PTZ腹腔注射。模型组、丙戊酸钠组、茸菖胶囊组均采用PTZ慢性点燃动物模型。1次/日,注射后30min内观察大鼠行为学变化,连续28天。正常组腹腔注射等剂量生理盐水。随后对各组体重、惊厥行为学、惊厥潜伏期、空间学习记忆能力等进行统计学分析。结果(1)惊厥潜伏期比较:预处理结束后,茸菖胶囊组、丙戊酸钠组惊厥潜伏期均要长于模型组(P<0.05);(2)逃避潜伏期的比较:随着训练时间延长,各组逃避潜伏期变化情况不一,到训练第4天,模型组、丙戊酸钠组逃避潜伏期较正常组和茸菖胶囊组明显延长(P<0.05);(3)跨越平台次数的比较:茸菖胶囊组跨越平台数均明显高于正常组、模型组、丙戊酸钠组(P<0.05)。结论通过预处理给药的方法,可以明显提高致痫大鼠惊厥潜伏期,减轻发作程度,并能提高致痫大鼠认知功能,但影响致痫大鼠体重轻微变化。

重视增智在儿童抗癫痫治疗中的作用

癫痫，尤其是强直一阵孪性发作的患儿，约30-50％伴有认知功能障碍。儿童的认知功能涉及智力、记忆力、理解力、注意力等方面。癫痫儿童的认识障碍主要病因在于脑损害及长期服用抗癫痫药物，前者又与起病年龄、发作类型及发作严重程度密切相关，遗传和环境因素也有一定的作用。1988年“全国0～14岁儿童智力低下流行病学调查”结果显示.