基于网络药理学和分子对接探讨荆防药对正丁醇部位分离物A的抗氧化作用机制

目的:应用网络药理学方法和分子对接技术研究荆芥防风药对正丁醇部位分离物A(JFNEA)抗氧化的主要活性成分、关键靶点及作用机制,并采用体外细胞实验对相关靶点进行初步验证。方法:采用质谱分析鉴定荆防药对正丁醇部位分离物A的有效成分,通过中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)筛选活性成分,获得主要成分对应靶点;使用Uniprot数据库得到化合物对应关键靶点的基因;通过GeneCards数据库获得氧化应激对应靶点;运用Cytoscape 3.7.2软件构建、分析网络;采用STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用分析,通过度值(Degree)筛选关键靶点;使用DAVID数据库对荆防药对正丁醇部位分离物A抗氧化关键靶点进行基因本体(GO)富集分析和KEGG通路富集分析,以探究其作用机制。最后采用Discovery Studio(DS)软件进行分子对接,将药物活性成分与靶基因进行结合活性的双重验证。以脂多糖致RAW264.7细胞氧化应激模型为载体,观察荆防药对正丁醇部位分离物A对模型细胞PI3K/AKT/NRF2信号通路中相关蛋白表达量的影响。结果:荆防药对正丁醇部位分离物A中共有11个活性化合物,主要是黄酮类、多酚类、萜类化合物,将其主要活性成分调控的靶点与氧化应激靶点取交集,得到160个关键靶点;关键靶点涉及AKT1、TP53、INS、MAPK3、IL-6、CASP3、VEGFA、JUN、MAPK1、TNF、EGFR、STAT3等,GO分析得到GO条目129个(P<0.05),其中生物过程(BP)条目89个,细胞成分(CC)条目14个,分子功能(MF)条目26个;KEGG通路富集筛选得到81条信号通路(P<0.05),主要涉及PI3K-AKT信号通路。分子对接结果验证了橙皮素、尿苷、橙皮苷、木犀草素、3-O-阿魏酰奎尼酸、原儿茶酸、芫花素是重要成分,对MAPK1、IL-6、TNF、VEGFA、AKT1作用明显。细胞实验发现,与模型对照组比较,荆防药对正丁醇部位分离物A预处理能明显下调p-AKT、p-PI3K、KEAP1蛋白表达水平,上调NRF2、SOD1蛋白表达水平,表现出显著抗氧化作用。结论:荆防药对正丁醇部位分离物A可能通过调控与氧化应激相关蛋白以及PI3K-AKT信号通路来发挥抗氧化作用,其中橙皮素、尿苷、橙皮苷、木犀草素、3-O-阿魏酰奎尼酸、原儿茶酸、芫花素可能是重要成分,揭示了该分离物A抗氧化作用的有效成分及潜在靶点。

黄药子正丁醇部位化学成分研究

目的:研究黄药子正丁醇部位化学成分。方法:采用硅胶、凝胶柱色谱、制备液相色谱等方法对黄药子正丁醇部位进行分离纯化,运用波谱数据鉴定化合物结构。结果:从黄药子正丁醇部位分离得到15个化合物,依次为8-表黄独素E-乙酸酯(1)、黄独素B(2)、黄独素F(3)、3,5,3'-三甲氧基槲皮素(4)、5,6,7-三甲氧基黄酮(5)、5,7,8-三甲氧基二氢黄酮(6)、5-羟基-7,8,2',5'-四甲氧基黄酮(7)、β-谷甾醇(8)、熊果醇(9)、薯蓣皂苷元(10)、3,7-二羟基-2,4-二甲氧基-9,10-二氢菲(11)、3,7-二羟基-2,4-二甲氧基菲(12)、肉桂酸(13)、香草酸(14)、3,4-O-异亚丙基莽草酸(15)。结论:首次从该植物中分离得到化合物5~7、9、13、15。

荆防散乙酸乙酯萃取部位及分离物的抗过敏作用研究

目的:进一步明确荆防散乙酸乙酯萃取部位及其分离物的抗过敏作用,探讨其作用机制,初步揭示其有效物质基础。方法:采用C48/80刺激RBL-2H3细胞脱颗粒实验,以β-氨基己糖苷酶释放为评价指标初步筛选各分离物的抗过敏作用;采用半抗原DNFB(2,4-二硝基氟苯)诱导小鼠变应性接触性皮炎模型(ACD模型),观察荆防散乙酸乙酯萃取部位及其分离物的抗过敏作用与机制。结果:荆防散乙酸乙酯部位及其分离物对C48/80诱导的RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶的释放均表现出一定的抑制作用;荆防散乙酸乙酯分离物A、C、D能抑制DNFB诱导所致的变应性接触性皮炎模型小鼠的耳肿胀度,并降低耳组织中IL-4、IFN-γ、TNF-α水平;分离物D显著降低模型小鼠血清IgE水平,分离物C对模型小鼠耳组织的病理损伤改善作用较优。荆防散乙酸乙酯萃取部位对模型小鼠耳组织中IL-4、IFN-γ及血清中IgE水平亦有降低作用。结论:荆防散乙酸乙酯萃取部位抗过敏作用明确,其分离物A、C、D为其主要有效物质,其中分离物D能显著抑制IgE生成,可能作用于过敏反应初级阶段,分离物A、C则对致敏后期相关过敏介质的释放具有抑制作用。

荆防药对正丁醇提取部位分离物A对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的影响

该研究以LPS诱导的RAW264. 7细胞炎症模型为载体,观察荆防药对正丁醇提取部位分离物A组分的体外抗炎作用,及其调控NF-κB,PI3K/AKT信号通路的抗炎作用机制。建立LPS诱导的RAW264. 7细胞炎症模型,荆防药对正丁醇提取部位分离物A组分预处理3 h,取细胞上清ELISA法测定炎症因子IL-6,IL-1β,TNF-α含量; Griess法测定NO含量; RT-PCR法测定RAW264. 7炎症细胞中IL-6,IL-1β,TNF-α,IFN-γ,i NOS,PI3K,AKT,CHUK,NF-κB1,Rela mRNA表达; Western blot法测定细胞中PI3K,AKT,NF-κB p50,p65,p105总蛋白及磷酸化蛋白p-PI3K,p-AKT,p-p65的表达水平。并采用LC-MS及数据库对比鉴定分离物A中可能的化学成分。结果显示,荆防药对正丁醇提取部位分离物A组分显著抑制LPS致RAW264. 7细胞炎症模型上清中NO,IL-6,IL-1β,TNF-α炎症因子的释放(P<0. 05或P<0. 01),降低IL-6,IL-1β,TNF-α,IFN-γmRNA表达水平,显著下调炎症模型细胞中PI3K,AKT mRNA表达及蛋白磷酸化表达水平(P<0. 05或P<0. 01);显著降低炎症模型细胞NF-κB p50,p-p65,i NOS蛋白水平,以及NF-κB1,Rela mRNA表达水平,上调CHUK基因表达。成分分析共鉴定出分离物A组分含化合物196种,其中isoobtusilactone,5-O-甲基维斯阿米醇苷,蒽贝素(embelin),升麻素苷含量较高。综上,荆防药对正丁醇提取部位分离物A组分体外对LPS诱导的RAW264. 7细胞炎症模型具有较好抗炎效应,作用发挥与其抑制PI3K/AKT信号通路活化及NF-κB信号通路活化有关,蒽贝素可能为其抗炎作用发挥的主要有效成分之一。

荆防药对正丁醇提取部位抗炎作用的NF-κB信号通路机制研究

目的观察荆防药对正丁醇提取部位对气管滴注脂多糖(LPS)所致小鼠急性肺损伤(ALI)模型及LPS刺激诱导的小鼠单核巨噬白血病细胞(RAW264. 7细胞)炎症模型的保护作用,探讨其抗炎效应的核转录因子-κB(NF-κB)信号通路机制。方法 (1)小鼠ALI模型:将雄性昆明种小鼠分为空白对照组,假手术组,模型组,地塞米松(5 mg/kg)+LPS组,荆防药对正丁醇部位低、中、高剂量(3. 33、6. 67、10. 01 g/kg)+LPS组,除地塞米松组于实验第2、4、5天腹腔注射给药1次外,其余各组动物连续灌胃给药5 d,1次/d,空白对照组、假手术组和模型组给予等体积0. 5%吐温溶液。末次给药30 min后,除空白对照组和假手术组外其余各组小鼠气管滴注LPS 100μL(5 mg/kg)制备小鼠ALI模型,假手术组小鼠行麻醉、气管滴注操作,但给予无菌生理盐水。造模后5 h各组再次给药1次,给予LPS后6 h处死小鼠,取小鼠肺组织进行病理形态学观察,Real-Time PCR法检测小鼠肺组织NF-κB p65、NF-κB p50、IκBαmRNA表达水平,Western-Blot法检测小鼠肺组织NF-κB p50蛋白表达水平。(2)RAW264. 7细胞炎症模型:取对数期RAW264. 7细胞悬液接种、培养24 h贴壁后,设空白对照组,LPS组(1 mg/L),LPS+DMSO对照组,LPS+地塞米松(5 mg/L)组,LPS+荆防药对正丁醇部位高、低剂量组(50、25 mg/L),LPS+5-O-甲基维斯阿米醇苷高、低剂量组(50、25 mg/L),LPS+橙皮苷组(50μg/L),LPS+迷迭香酸组(5 mg/L)。受试药物预处理3 h,除空白对照组外其余各组均加入1 mg/L LPS刺激12 h造模,吸取细胞上清,Griess法测定一氧化氮(NO)含量,ELISA法测定白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;裂解细胞,Real-Time PCR法检测细胞NF-κB p65、NF-κB p50和IκBαmRNA表达水平。结果 (1)与LPS所致小鼠ALI模型组比较,荆防药对正丁醇部位各剂量组可减少ALI小鼠肺组织嗜中性粒细胞计数,其中低剂量组降低作用显著(P <0. 01);荆防药对正丁醇部位中、低剂量组显著下调ALI小鼠肺组织NF-κB p65mRNA及NF-κB p50蛋白表达水平(P <0. 01),中剂量组亦明显下调NF-κB p50 mRNA表达水平(P <0. 05)。(2)与细胞炎症模型组比较,所有受试药物均能明显降低细胞上清IL-6水平(P <0. 01或P <0. 05),荆防药对正丁醇部位(50、25 mg/L)、5-O-甲基维斯阿米醇苷低剂量组可显著降低细胞上清NO含量(P <0. 01或P <0. 05),荆防药对正丁醇部位高剂量组有减少细胞上清TNF-α含量的趋势;荆防药对正丁醇部位低剂量组显著下调细胞NF-κB p65、NF-κB p50、IκBαmRNA表达水平(P <0. 05或P <0. 01),高剂量组明显抑制细胞NF-κB p50、IκBαmRNA表达(P <0. 05或P<0. 01),5-O-甲基维斯阿米醇苷和橙皮苷亦可显著下调细胞NF-κB p50 mRNA表达水平(P <0. 05),迷迭香酸明显抑制模型细胞NF-κB p50和IκBαmRNA表达的上调(P <0. 05)。结论荆防药对正丁醇提取部位具有抗急性炎症作用,抗炎作用发挥与抑制NF-κB信号通路中关键因子NF-κBp65、NF-κB p50、IκBα基因及NF-κB p50蛋白表达有关,5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷与迷迭香酸可能为其主要有效物质基础。