喜树碱诱导的草地贪夜蛾Sf9细胞凋亡

传统植物源杀虫剂喜树碱具有优异的抑制昆虫生长发育活性,其诱导昆虫细胞凋亡的作用方式和机制尚不明确,极大地限制了喜树碱在植物保护领域的应用开发。本研究以1μmol/L喜树碱诱导草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda Sf9细胞呈现细胞皱缩、微绒毛消失和染色质边集等典型细胞凋亡早期超微结构形态特征,中期凋亡小体逐渐出现并急剧增多,DNA电泳分析可见清晰DNA片段化凋亡特征。流式细胞术分析表明1μmol/L喜树碱诱导Sf9细胞12h凋亡率达到最大值39.67%,是对照的13.13倍,随后减小。喜树碱诱导Sf9细胞凋亡在12h和24h时Sf caspase-1分别出现两个活性高峰,表明其作为效应因子在细胞凋亡级联反应过程中具有影响作用。喜树碱显著抑制Sf9细胞拓扑异构酶Ⅰ活性,阻断解旋负超螺旋pBR322DNA,导致DNA损伤进而启动细胞凋亡级联反应使Sfcaspase-1活性增加,提示其信号转导过程是细胞凋亡诱导机制之一。本研究通过分析喜树碱的诱导昆虫Sf9细胞凋亡,对揭示喜树碱诱导昆虫细胞凋亡的作用机制具有重要启示和帮助。

斑蝥素诱导草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9凋亡的临界条件

为进一步利用昆虫细胞研究斑蝥素对鳞翅目昆虫的毒杀机理,采用细胞形态学观察法和DNA凝胶电泳法研究斑蝥素诱导草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9细胞凋亡的临界条件。结果表明:供试细胞凋亡率与斑蝥素处理剂量、时间呈现密切相关性;在较低剂量处理下,可观察到细胞凋亡。当斑蝥素质量浓度达到6.25μg/mL,处理细胞3 h或3.125μg/mL处理细胞12 h时,斑蝥素处理Sf9导致细胞出现明显畸形、形成凋亡小体等凋亡症状。DNA Ladder条件要求严格,在冰浴条件下,当斑蝥素处理质量浓度达到6.25μg/mL处理细胞24 h时,或者12.5μg/mL处理细胞12 h时,可观察到明显的DNA梯度条带。

草地贪夜蛾Sf9细胞对饥饿诱导自噬的响应

为研究草地贪夜蛾对饥饿诱导自噬的响应。从草地贪夜蛾EST数据库中筛选到一段核苷酸序列,设计特异性引物,RT-PCR技术从草地贪夜蛾Sf9细胞中扩增该核苷酸序列,经过生物信息学分析该序列与昆虫自噬相关基因ATG8同源性最高,命名为SfATG8基因,并构建了pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8载体转染Sf9细胞。Sf9细胞经饥饿(PBS)诱导4 h后,Lyso-Tracker染色、Western Blotting、共聚焦显微镜检测细胞对自噬的响应程度。结果表明,经饥饿(PBS)诱导4 h的Sf9细胞中出现Sf Atg8-PE的表达,共聚焦显微镜检测到Sf9细胞膜上的自噬小体。以上证据证实饥饿(PBS)能诱导Sf9细胞发生自噬,为深入研究Sf9细胞对自噬的响应奠定了基础。

吖啶橙对草地贪夜蛾sf9细胞和AcMNPV病毒的损伤效应

背景与目的:探索吖啶橙对昆虫细胞的遗传损伤。材料与方法:用不同浓度的吖啶橙处理草地贪夜蛾Sf9细胞、AcMNPV病毒,观察其对细胞生长发育,微核发生率,AcMNPV感染力的影响。结果:sf9细胞经5μg/ml的吖啶橙处理后,细胞分裂生长速度减慢,细胞表面粗糙,微核发生率为10.4‰,10μg/ml时可引起细胞膜破碎或死亡,微核发生率为22‰,出现三核,多核甚至核裂现象。当AcMNPV经吖啶橙处理后再感染sf9细胞,AcMNPV可在细胞内增殖,形成多角体,并出现一些类似三角形或四角形的异常多角体。结论:用一定剂量的吖啶橙处理草地贪夜蛾sf9细胞和AcMNPV病毒,可对细胞产生损伤和引起AcMNPV发生异常多角体。

斑蝥素对草地贪夜蛾Sf9细胞膜完整性和膜电位的影响

为明确斑蝥素对昆虫细胞膜的作用及其机理,本研究利用草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的卵巢细胞系Sf9细胞作为实验材料,采用透射电子显微技术(transmission electron microscope,TEM)、激光共聚焦显微镜(laserscanning confocal microscope,LSCM)结合荧光探针FDA/PI及DiBAC4(3)技术研究斑蝥素(cantharidin,CTD)对Sf9细胞膜完整性及膜电位(membrane potential,MP)的影响。结果表明:32μmol/L CTD处理6h和12h后,电镜观察均未发现细胞膜结构破损;FDA/PI染色后,32μmol/L CTD处理0.5h后细胞FDA荧光强度比对照显著降低(P<0.05),碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色的细胞比例与对照无显著性差异(P≥0.05)。32μmol/L CTD处理140s后即引起MP发生显著性去极化(P<0.05);64μmol/L CTD处理瞬时MP发生显著性去极化(P<0.05);32μmol/L CTD处理3h内及64μmol/L CTD处理2h内MP仍保持显著性去极化(P<0.05),之后去极化程度降低;32μmol/L CTD处理6h及64μmol/L CTD处理3h时MP去极化与对照组相比已无显著性差异(P≥0.05)。结果说明,CTD处理短时间内可引起Sf9细胞膜电位去极化并维持一段时间,同时导致细胞活性发生不可逆下降,但未对细胞膜结构完整性产生破坏。

高效氯氰菊酯对草地贪夜蛾Sf9细胞自噬的诱导作用

采用噻唑蓝(MTT)染色、显微镜及透射电子显微镜观察、单丹磺酰戊二胺(MDC)荧光染色及蛋白质免疫印迹(WB)技术等方法,分别针对高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin)作用后草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞系Sf9细胞的细胞活力、自噬发生的典型特征及自噬相关蛋白变化情况进行了测试及分析。结果表明:经不同浓度高效氯氰菊酯处理后,对草地贪夜蛾Sf9细胞活性的抑制效应与作用剂量及时间呈现依赖关系,并表现出典型的细胞自噬现象;LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平比和Beclin 1蛋白表达量呈现上调趋势,分别为对照组的201.32%和136.00%,p62蛋白表达量下调至对照组的68.13%。研究表明,高效氯氰菊酯对草地贪夜蛾Sf9细胞具有显著的细胞毒性,并且其对细胞活力的抑制作用与自噬诱导途径相关。

草地贪夜蛾细胞系IPLB-Sf-9酵母双杂交cDNA文库的构建

草地贪夜蛾Spdoptera frugiperda是危害玉米、高粱等农作物的重要害虫。草地贪夜蛾卵巢细胞系IPLB-Sf-9(Sf9)广泛应用于病毒学研究和真核生物基因表达。本研究从Sf9细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的Sf9细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库。Sf9细胞总RNA的电泳谱型与哺乳动物总RNA存在差异,其28S rRNA带弱于18S rRNA带,所合成的原始ds cDNA大小为0.1～4kb。文库展现良好的多态性,载体质粒插入的cDNA片段大小大部分在0.3～2kb之间。Sf9细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库的构建为草地贪夜蛾功能基因的识别和鉴定,为研究杆状病毒与宿主细胞的互作机制提供了重要研究工具。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞在生物反应器中培养条件初探

对草地贪夜蛾（ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ） Ｓｆ９ 细胞在２ Ｌ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｒ Ｍ Ｄ 型搅拌式生物反应器中进行了培养，并对细胞的生长状况、葡萄糖的消耗等进行了测定；对重组病毒的增殖、外源基因的表达进行了初步探索．结果表明：细胞在该生物反应器中生长良好，细胞群体倍增时间３３．４ ｈ．病毒感染率大约在 ８９．８％ 以上。

不同杀虫成分对Sf9细胞凋亡的影响

通过倒置显微形态观察凋亡小体、DNA琼脂糖凝胶电泳确证的模型,研究了8种代表性杀虫成分对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体培养细胞系Sf9的凋亡诱导效果,以探讨不同杀虫成分对昆虫细胞凋亡的影响.结果表明,印楝素0.15-1.50μg/mL处理后72 h内、喜树碱0.35-3.50μg/mL处理后36 h,Sf9细胞产生大量典型凋亡小体,处理时间延长或剂量加大则以造成细胞坏死为主;DNA电泳产生典型的DNA Ladder,表明印楝素和喜树碱对Sf9具有明显的细胞凋亡诱导作用.印楝素1.5μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后24-48 h,喜树碱0.35-3.50μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后12 h.苦参碱、氟铃脲、毒死蜱、灭多威、氯氰菊酯以0.1-10.0μg/mL及昆虫蜕皮激素20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone）以0.048-4.800μg/mL处理后72 h内对Sf9均无明显的细胞凋亡诱导作用.杀虫剂对昆虫细胞凋亡诱导效应随供试化合物、细胞种类、处理剂量、处理时间而异.

重组hIL-12病毒在Sf9细胞传代中遗传稳定性的研究

将含重组白细胞介素12(hIL-12)的杆状病毒(Ac-hIL12)经空斑纯化后,在草地贪夜蛾Sf9细胞中进行连续无稀释传代到P55代,收集被P15、P25、P35、P45、P55代重组病毒感染的细胞,抽提胞内病毒(ICV)DNA。根据重组病毒构建的原理,在P35 cDNA和P40 cDNA的3茨┒紊杓埔欢砸锝蠵CR,扩增出了包括P35 cDNA、Polyhedrin启动子、P10启动子和P40 cDNA序列在内的全长约2.0kb片段,克隆至T Vector进行序列测定后发现,在第P15、P25和P35代所扩增出的序列没有发生任何突变。但在P45代,P35cDNA中就有3个碱基发生了点突变(461T C,517A G以及630C T),Polyhedrin启动子的+1位后插入了一个碱基T,P40 cDNA与P10启动子区(230bp)没有变化;而第P55代除了以上碱基突变以外,P10启动子区-168位的G替换突变为T, -136与-135位之间插入一个碱基T,以及-122位缺失一个碱基T。以上结果表明杆状病毒在体外细胞连续传代过程中可导致外源基因本身的突变。

重组杆状病毒AcMNPV-PK2-RFP诱导Sf9细胞凋亡的机制分析

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒是一种模式杆状病毒,在农业虫害防治中广泛应用。其表达的PK2蛋白可以通过竞争性的与宿主细胞e IF2α激酶结合形成异源二聚体,抑制其磷酸化e IF2α,从而加速病毒增殖、诱导细胞凋亡。为了探讨PK2诱导宿主Sf9细胞凋亡的机制,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了重组杆状病毒AcMNPV-PK2-RFP。Western blot分析结果表明,重组病毒AcMNPV-PK2-RFP处理组在病毒侵染后48,60,72 h,宿主细胞内凋亡因子SfP53蛋白的表达量显著高于AcMNPV处理组,分别是AcMNPV处理组的1.16倍、1.39倍和1.79倍;在病毒侵染后48,72 h,AcMNPV-PK2-RFP处理组反映线粒体膜电位的绿色荧光分别是野生处理组的1.54倍和1.89倍,表明AcMNPV-PK2-RFP处理组的线粒体膜电位显著低于野生病毒处理组;同时,观察到AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体中的细胞色素c从病毒侵染后12 h开始释放。结果说明,过表达PK2的重组病毒AcMNPV-PK2-RFP可在感染后期加速SfP53蛋白的表达,通过影响线粒体凋亡信号通路加速宿主Sf9细胞的凋亡,同时表明重组病毒AcMNPV-PK2-RFP是一种相比野生型病毒抗虫活性更高的杀虫剂。

杆状病毒AcMNPV中Ac109蛋白的抗虫功能分析

为研究苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中病毒增殖因子Ac109对鳞翅目害虫甜菜夜蛾幼虫的抗虫效应,采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了重组病毒AcMNPV-Ac109-EGFP。免疫印迹和荧光显微镜观察结果证实,重组病毒AcMNPV-Ac109-EGFP侵染昆虫Sf9细胞后Ac109的表达量和细胞的荧光强度随着侵染时间延长而显著增加。抗虫试验表明,与AcMNPV处理组、PBS对照组相比,AcMNPV-Ac109-EGFP病毒处理组的幼虫体质量增长缓慢,有较高的致死率和低的蛹化率及羽化率;AcMNPV与AcMNPV-Ac109-EGFP病毒处理组的最终死亡率分别为58.33%和73.33%;蛹化率分别为41.667%和25.000%;羽化率分别为20.00%和11.67%,说明Ac109可提高病毒对甜菜夜蛾幼虫的抗虫性。以上结果构建了1株高抗虫活性的重组病毒,并为这个重组病毒潜在的应用价值提供了试验依据。

基于CRISPR/Cas9系统分析草地贪夜蛾Wnt1基因的生物学功能

为明确草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda中Wnt1基因的生物学功能,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术检测草地贪夜蛾胚胎发育期Wnt1基因的表达谱,利用CRISPR/Cas9系统对Wnt1基因进行定向敲除,并通过qPCR技术检测草地贪夜蛾Wnt1基因缺失突变体中与昆虫发育相关基因的表达水平。结果显示,Wnt1基因在草地贪夜蛾整个胚胎发育期均有表达,在胚胎发育早期(6 h)表达水平最高。将SfWnt1-sgRNA和Cas9蛋白混合注入草地贪夜蛾卵中,胚胎死亡率明显升高,同时获得了Wnt1基因缺失的草地贪夜蛾突变体。突变率与注射浓度相关,注射浓度越高,突变率越高;当SfWnt1-sgRNA和Cas9蛋白混合后终浓度均为300 ng/μL时,注射的724粒卵中获得体节缺陷突变体52头,附肢缺陷突变体64头,组织特化突变体20头;SfWnt1-sg RNA和Cas9蛋白混合后终浓度均为100 ng/μL时,注射的413粒卵中最终获得体节缺陷突变体14头,附肢缺陷突变体22头,组织特化突变体7头;这些突变体均无法存活至化蛹。草地贪夜蛾Wnt1基因被敲除后,与昆虫发育密切相关的17个基因表达水平均显著下调。表明Wnt1基因在草地贪夜蛾胚胎发育过程中发挥着至关重要的作用。

血管生长抑制因子angiostatin在昆虫细胞中的表达及活性研究

背景与目的:抑制新生血管的形成,有助于抑制肿瘤的生长,减少和预防肿瘤转移的发生。血管抑素(angiostatin)是一种重要的内源性新生血管生成抑制剂,对血管内皮细胞增殖有较强的抑制作用。为获得具有高活性的Angiostatin表达,本研究通过杆状病毒表达系统表达重组的angiostatin,分析其在昆虫细胞中表达和生物活性。方法:用带有angiostatin的杆状病毒转移载体pBlueBacHis2B和病毒DNA共同转染Sf9细胞,构建重组病毒,蚀斑实验筛选,PCR分析确定后扩增产生大量高滴度的病毒贮存液;用SDS-PAGE电泳和Westernblot对感染不同时间后分泌的重组蛋白做时间表达分析;用ProBondTM纯化系统对表达的重组angiostatin进行纯化,分光光度计确定蛋白含量,SDS-PAGE电泳确定蛋白纯度;采用MTT法测定重组蛋白angiostatin对原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用而后通过鸡胚尿囊膜实验进一步证实其抗血管形成作用。结果:成功构建了滴度为2×108pfu/ml的angiostatin重组杆状病毒,并在昆虫细胞Sf9中高效表达了分子量为53ku的angiostatin重组蛋白,纯度约为90%,重组angiostatin蛋白不仅在体外显著抑制内皮细胞的生长(IC50为2.3μg/ml),而且显著抑制鸡胚尿囊膜血管的生长。结论:此系统可制备高滴度angiostatin重组杆状病毒贮存液,并在Sf9昆虫细胞中高效表达该重组蛋白,经在体和离体细胞学实验验证其对内皮细胞的增殖具有抑制作用。

利用昆虫病毒系统生产表达胰岛素的腺相关病毒

腺相关病毒(Adeno-associated virus-2,AAV-2)用于构建基因治疗病毒载体,在基因治疗领域受到了普遍重视和关注,而rAAV在应用过程中一个很重要的限制因素就是缺乏简单有效的大规模制备方法.运用昆虫细胞表达系统来提高AAV-2的产量,分别采用绿色荧光蛋白(GFP)和胰岛素(Insulin)基因替代AAV-2的结构基因后,与其他重组病毒共转染293t细胞,3 d后即可检测到高效表达的GFP和Insulin.结果表明,该方法能够比较理想地提高AAV的产量,为临床使用奠定了基础.

昆虫不育技术在害虫防治中的应用和研究进展

昆虫不育技术是一种通过释放不育昆虫来控制田间害虫种群的生物防治新策略。为将昆虫不育技术应用于防治全球入侵害虫草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda,该文对昆虫不育技术的作用机理和防治现状进行了综述,并对国内外利用该技术成功防治害虫的作用原理、作用方式和对多种害虫防治的成功案例进行了归纳;同时,对防治靶标基因doublesex的功能性作用进行总结。本综述基于CRISPR/Cas9基因编辑系统调控靶标基因,整理并展望通过释放携带显性致死基因的昆虫种群实现虫口密度控制的研究现状,为促进昆虫不育技术防治害虫提供理论基础。