家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。

喜树碱诱导的草地贪夜蛾Sf9细胞凋亡

传统植物源杀虫剂喜树碱具有优异的抑制昆虫生长发育活性,其诱导昆虫细胞凋亡的作用方式和机制尚不明确,极大地限制了喜树碱在植物保护领域的应用开发。本研究以1μmol/L喜树碱诱导草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda Sf9细胞呈现细胞皱缩、微绒毛消失和染色质边集等典型细胞凋亡早期超微结构形态特征,中期凋亡小体逐渐出现并急剧增多,DNA电泳分析可见清晰DNA片段化凋亡特征。流式细胞术分析表明1μmol/L喜树碱诱导Sf9细胞12h凋亡率达到最大值39.67%,是对照的13.13倍,随后减小。喜树碱诱导Sf9细胞凋亡在12h和24h时Sf caspase-1分别出现两个活性高峰,表明其作为效应因子在细胞凋亡级联反应过程中具有影响作用。喜树碱显著抑制Sf9细胞拓扑异构酶Ⅰ活性,阻断解旋负超螺旋pBR322DNA,导致DNA损伤进而启动细胞凋亡级联反应使Sfcaspase-1活性增加,提示其信号转导过程是细胞凋亡诱导机制之一。本研究通过分析喜树碱的诱导昆虫Sf9细胞凋亡,对揭示喜树碱诱导昆虫细胞凋亡的作用机制具有重要启示和帮助。

吖啶橙对草地贪夜蛾sf9细胞和AcMNPV病毒的损伤效应

背景与目的:探索吖啶橙对昆虫细胞的遗传损伤。材料与方法:用不同浓度的吖啶橙处理草地贪夜蛾Sf9细胞、AcMNPV病毒,观察其对细胞生长发育,微核发生率,AcMNPV感染力的影响。结果:sf9细胞经5μg/ml的吖啶橙处理后,细胞分裂生长速度减慢,细胞表面粗糙,微核发生率为10.4‰,10μg/ml时可引起细胞膜破碎或死亡,微核发生率为22‰,出现三核,多核甚至核裂现象。当AcMNPV经吖啶橙处理后再感染sf9细胞,AcMNPV可在细胞内增殖,形成多角体,并出现一些类似三角形或四角形的异常多角体。结论:用一定剂量的吖啶橙处理草地贪夜蛾sf9细胞和AcMNPV病毒,可对细胞产生损伤和引起AcMNPV发生异常多角体。

斑蝥素对草地贪夜蛾Sf9细胞膜完整性和膜电位的影响

为明确斑蝥素对昆虫细胞膜的作用及其机理,本研究利用草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的卵巢细胞系Sf9细胞作为实验材料,采用透射电子显微技术(transmission electron microscope,TEM)、激光共聚焦显微镜(laserscanning confocal microscope,LSCM)结合荧光探针FDA/PI及DiBAC4(3)技术研究斑蝥素(cantharidin,CTD)对Sf9细胞膜完整性及膜电位(membrane potential,MP)的影响。结果表明:32μmol/L CTD处理6h和12h后,电镜观察均未发现细胞膜结构破损;FDA/PI染色后,32μmol/L CTD处理0.5h后细胞FDA荧光强度比对照显著降低(P<0.05),碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色的细胞比例与对照无显著性差异(P≥0.05)。32μmol/L CTD处理140s后即引起MP发生显著性去极化(P<0.05);64μmol/L CTD处理瞬时MP发生显著性去极化(P<0.05);32μmol/L CTD处理3h内及64μmol/L CTD处理2h内MP仍保持显著性去极化(P<0.05),之后去极化程度降低;32μmol/L CTD处理6h及64μmol/L CTD处理3h时MP去极化与对照组相比已无显著性差异(P≥0.05)。结果说明,CTD处理短时间内可引起Sf9细胞膜电位去极化并维持一段时间,同时导致细胞活性发生不可逆下降,但未对细胞膜结构完整性产生破坏。

高效氯氰菊酯对草地贪夜蛾Sf9细胞自噬的诱导作用

采用噻唑蓝(MTT)染色、显微镜及透射电子显微镜观察、单丹磺酰戊二胺(MDC)荧光染色及蛋白质免疫印迹(WB)技术等方法,分别针对高效氯氰菊酯(beta-cypermethrin)作用后草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞系Sf9细胞的细胞活力、自噬发生的典型特征及自噬相关蛋白变化情况进行了测试及分析。结果表明:经不同浓度高效氯氰菊酯处理后,对草地贪夜蛾Sf9细胞活性的抑制效应与作用剂量及时间呈现依赖关系,并表现出典型的细胞自噬现象;LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平比和Beclin 1蛋白表达量呈现上调趋势,分别为对照组的201.32%和136.00%,p62蛋白表达量下调至对照组的68.13%。研究表明,高效氯氰菊酯对草地贪夜蛾Sf9细胞具有显著的细胞毒性,并且其对细胞活力的抑制作用与自噬诱导途径相关。

草地贪夜蛾细胞系IPLB-Sf-9酵母双杂交cDNA文库的构建

草地贪夜蛾Spdoptera frugiperda是危害玉米、高粱等农作物的重要害虫。草地贪夜蛾卵巢细胞系IPLB-Sf-9(Sf9)广泛应用于病毒学研究和真核生物基因表达。本研究从Sf9细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的Sf9细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库。Sf9细胞总RNA的电泳谱型与哺乳动物总RNA存在差异,其28S rRNA带弱于18S rRNA带,所合成的原始ds cDNA大小为0.1～4kb。文库展现良好的多态性,载体质粒插入的cDNA片段大小大部分在0.3～2kb之间。Sf9细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库的构建为草地贪夜蛾功能基因的识别和鉴定,为研究杆状病毒与宿主细胞的互作机制提供了重要研究工具。

家蚕微孢子虫侵染家蚕胚胎细胞与草地贪夜蛾细胞的病变比较

家蚕微孢子虫(Nosema bom bycis)是引起家蚕微粒子病的病原,是一种无线粒体的专性细胞内寄生的原虫。将N.bom bycis经KOH处理后,接种于家蚕胚胎细胞(BmE细胞)和草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)。用倒置显微镜对微孢子虫在宿主细胞中感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察,比较两种细胞接种N.bom bycis后所出现的形态学变化。接种后第12天起,两种细胞内均充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动。在感染晚期,Sf21中有许多孢子从细胞中逸出,留下许多空泡,细胞还保持一定的完整性,而家蚕胚胎细胞则在感染后期完全崩解。这种差异可能是Sf21作为一种非原宿主细胞,对N.bom bycis的感染有一定耐受性有关。

骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾离体细胞系和幼虫血细胞的毒性作用

【目的】研究骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾幼虫的杀虫作用机理,为此类生物碱作为新型植物杀虫剂的开发应用提供理论依据。【方法】从骆驼蓬成熟种子中提取骆驼蓬总碱,采用MTT法测定0,1,5,10和20μg/mL骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系(Sf9)的毒性;测定5μg/mL骆驼蓬总碱在处理10,30,50,70和90min时对Sf9细胞Na^+和K^+吸收的影响,并测定5μg/mL骆驼蓬总碱在处理1,2,3,4,5d后对葡萄糖吸收的影响;最后采用叶碟法(叶碟在20μg/mL骆驼蓬总碱中浸3s)和注射法(2μg/头)分别测定处理1,8,16,24和48h时骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾4龄幼虫血细胞数量的影响。【结果】10和20μg/mL骆驼蓬总碱处理草地贪夜蛾Sf9细胞24h后,对细胞的抑制率分别为62.04%和83.25%;骆驼蓬总碱处理后8,16,24和48h,其对草地贪夜蛾Sf9细胞的LC50分别为35.32,23.21,14.87和8.98μg/mL,骆驼蓬总碱对Sf9细胞的毒性有时间滞后效应。5μg/mL骆驼蓬总碱处理Sf9细胞后10min,Sf9细胞对Na^+、K^+的吸收速率明显增加,处理后30min Sf9细胞对Na^+、K^+的吸收逐渐减弱;处理后3dSf9细胞对葡萄糖的吸收迅速增加,处理后4dSf9细胞对葡萄糖的吸收趋于停止。以叶碟法和注射法处理草地贪夜蛾4龄幼虫,8h后幼虫血细胞数量显著降低,但随时间延长幼虫血细胞数量又逐渐增加。【结论】骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf9有明显的毒杀活性,且对Sf9细胞中Na^+、K^+和葡萄糖的吸收具有抑制作用;对草地贪夜蛾4龄幼虫血细胞数量也有明显的抑制作用。

胡椒碱对SF-21细胞株的杀伤作用及对其形态影响的研究

目的检测胡椒碱对草地贪夜蛾SF-21细胞的毒性作用和生长抑制作用,以便进一步研究其对昆虫细胞离子通道的影响。方法胡椒碱处理SF-21细胞后,用MTT微量酶反应比色法、改良微波Giemsa染色法检测细胞死亡率及形态学改变,用冲击式测试法检测细胞生长率及受损细胞的恢复。结果胡椒碱处理24h后,对SF-21细胞的半数毒性浓度(IC50)为95.37μg/ml,且毒性作用强度随着药物浓度增加而增强。胡椒碱浓度在10μg/ml以上时可诱发SF-21细胞形态学改变,表现为细胞呈多形性、细胞间有间隙、胞质内充满颗粒,以后随药物浓度的升高,胞质出现空泡、染色质凝成粗大颗粒或无结构大块、大片细胞脱落、崩解、死亡。低浓度胡椒碱(5μg/ml)对SF-21细胞增殖没有影响,较高浓度胡椒碱(10、20、40μg/ml)则对SF-21细胞增殖有明显的抑制作用,抑制作用强度随药物浓度的增加而增加,去除药物作用后,受抑制的细胞又重新恢复生长、分裂。结论胡椒碱对昆虫细胞有较强的毒性作用和生长抑制作用,可作为新型杀虫剂的功能物质。

不同杀虫成分对Sf9细胞凋亡的影响

通过倒置显微形态观察凋亡小体、DNA琼脂糖凝胶电泳确证的模型,研究了8种代表性杀虫成分对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体培养细胞系Sf9的凋亡诱导效果,以探讨不同杀虫成分对昆虫细胞凋亡的影响.结果表明,印楝素0.15-1.50μg/mL处理后72 h内、喜树碱0.35-3.50μg/mL处理后36 h,Sf9细胞产生大量典型凋亡小体,处理时间延长或剂量加大则以造成细胞坏死为主;DNA电泳产生典型的DNA Ladder,表明印楝素和喜树碱对Sf9具有明显的细胞凋亡诱导作用.印楝素1.5μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后24-48 h,喜树碱0.35-3.50μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后12 h.苦参碱、氟铃脲、毒死蜱、灭多威、氯氰菊酯以0.1-10.0μg/mL及昆虫蜕皮激素20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone）以0.048-4.800μg/mL处理后72 h内对Sf9均无明显的细胞凋亡诱导作用.杀虫剂对昆虫细胞凋亡诱导效应随供试化合物、细胞种类、处理剂量、处理时间而异.

重组hIL-12病毒在Sf9细胞传代中遗传稳定性的研究

将含重组白细胞介素12(hIL-12)的杆状病毒(Ac-hIL12)经空斑纯化后,在草地贪夜蛾Sf9细胞中进行连续无稀释传代到P55代,收集被P15、P25、P35、P45、P55代重组病毒感染的细胞,抽提胞内病毒(ICV)DNA。根据重组病毒构建的原理,在P35 cDNA和P40 cDNA的3茨┒紊杓埔欢砸锝蠵CR,扩增出了包括P35 cDNA、Polyhedrin启动子、P10启动子和P40 cDNA序列在内的全长约2.0kb片段,克隆至T Vector进行序列测定后发现,在第P15、P25和P35代所扩增出的序列没有发生任何突变。但在P45代,P35cDNA中就有3个碱基发生了点突变(461T C,517A G以及630C T),Polyhedrin启动子的+1位后插入了一个碱基T,P40 cDNA与P10启动子区(230bp)没有变化;而第P55代除了以上碱基突变以外,P10启动子区-168位的G替换突变为T, -136与-135位之间插入一个碱基T,以及-122位缺失一个碱基T。以上结果表明杆状病毒在体外细胞连续传代过程中可导致外源基因本身的突变。

重组杆状病毒AcMNPV-PK2-RFP诱导Sf9细胞凋亡的机制分析

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒是一种模式杆状病毒,在农业虫害防治中广泛应用。其表达的PK2蛋白可以通过竞争性的与宿主细胞e IF2α激酶结合形成异源二聚体,抑制其磷酸化e IF2α,从而加速病毒增殖、诱导细胞凋亡。为了探讨PK2诱导宿主Sf9细胞凋亡的机制,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了重组杆状病毒AcMNPV-PK2-RFP。Western blot分析结果表明,重组病毒AcMNPV-PK2-RFP处理组在病毒侵染后48,60,72 h,宿主细胞内凋亡因子SfP53蛋白的表达量显著高于AcMNPV处理组,分别是AcMNPV处理组的1.16倍、1.39倍和1.79倍;在病毒侵染后48,72 h,AcMNPV-PK2-RFP处理组反映线粒体膜电位的绿色荧光分别是野生处理组的1.54倍和1.89倍,表明AcMNPV-PK2-RFP处理组的线粒体膜电位显著低于野生病毒处理组;同时,观察到AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体中的细胞色素c从病毒侵染后12 h开始释放。结果说明,过表达PK2的重组病毒AcMNPV-PK2-RFP可在感染后期加速SfP53蛋白的表达,通过影响线粒体凋亡信号通路加速宿主Sf9细胞的凋亡,同时表明重组病毒AcMNPV-PK2-RFP是一种相比野生型病毒抗虫活性更高的杀虫剂。

血管生长抑制因子angiostatin在昆虫细胞中的表达及活性研究

背景与目的:抑制新生血管的形成,有助于抑制肿瘤的生长,减少和预防肿瘤转移的发生。血管抑素(angiostatin)是一种重要的内源性新生血管生成抑制剂,对血管内皮细胞增殖有较强的抑制作用。为获得具有高活性的Angiostatin表达,本研究通过杆状病毒表达系统表达重组的angiostatin,分析其在昆虫细胞中表达和生物活性。方法:用带有angiostatin的杆状病毒转移载体pBlueBacHis2B和病毒DNA共同转染Sf9细胞,构建重组病毒,蚀斑实验筛选,PCR分析确定后扩增产生大量高滴度的病毒贮存液;用SDS-PAGE电泳和Westernblot对感染不同时间后分泌的重组蛋白做时间表达分析;用ProBondTM纯化系统对表达的重组angiostatin进行纯化,分光光度计确定蛋白含量,SDS-PAGE电泳确定蛋白纯度;采用MTT法测定重组蛋白angiostatin对原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用而后通过鸡胚尿囊膜实验进一步证实其抗血管形成作用。结果:成功构建了滴度为2×108pfu/ml的angiostatin重组杆状病毒,并在昆虫细胞Sf9中高效表达了分子量为53ku的angiostatin重组蛋白,纯度约为90%,重组angiostatin蛋白不仅在体外显著抑制内皮细胞的生长(IC50为2.3μg/ml),而且显著抑制鸡胚尿囊膜血管的生长。结论:此系统可制备高滴度angiostatin重组杆状病毒贮存液,并在Sf9昆虫细胞中高效表达该重组蛋白,经在体和离体细胞学实验验证其对内皮细胞的增殖具有抑制作用。

杆状病毒AcMNPV中Ac109蛋白的抗虫功能分析

为研究苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中病毒增殖因子Ac109对鳞翅目害虫甜菜夜蛾幼虫的抗虫效应,采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了重组病毒AcMNPV-Ac109-EGFP。免疫印迹和荧光显微镜观察结果证实,重组病毒AcMNPV-Ac109-EGFP侵染昆虫Sf9细胞后Ac109的表达量和细胞的荧光强度随着侵染时间延长而显著增加。抗虫试验表明,与AcMNPV处理组、PBS对照组相比,AcMNPV-Ac109-EGFP病毒处理组的幼虫体质量增长缓慢,有较高的致死率和低的蛹化率及羽化率;AcMNPV与AcMNPV-Ac109-EGFP病毒处理组的最终死亡率分别为58.33%和73.33%;蛹化率分别为41.667%和25.000%;羽化率分别为20.00%和11.67%,说明Ac109可提高病毒对甜菜夜蛾幼虫的抗虫性。以上结果构建了1株高抗虫活性的重组病毒,并为这个重组病毒潜在的应用价值提供了试验依据。