家蚕微孢子虫侵染家蚕胚胎细胞与草地贪夜蛾细胞的病变比较

家蚕微孢子虫(Nosema bom bycis)是引起家蚕微粒子病的病原,是一种无线粒体的专性细胞内寄生的原虫。将N.bom bycis经KOH处理后,接种于家蚕胚胎细胞(BmE细胞)和草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)。用倒置显微镜对微孢子虫在宿主细胞中感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察,比较两种细胞接种N.bom bycis后所出现的形态学变化。接种后第12天起,两种细胞内均充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动。在感染晚期,Sf21中有许多孢子从细胞中逸出,留下许多空泡,细胞还保持一定的完整性,而家蚕胚胎细胞则在感染后期完全崩解。这种差异可能是Sf21作为一种非原宿主细胞,对N.bom bycis的感染有一定耐受性有关。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。

吖啶橙对草地贪夜蛾sf9细胞和AcMNPV病毒的损伤效应

背景与目的:探索吖啶橙对昆虫细胞的遗传损伤。材料与方法:用不同浓度的吖啶橙处理草地贪夜蛾Sf9细胞、AcMNPV病毒,观察其对细胞生长发育,微核发生率,AcMNPV感染力的影响。结果:sf9细胞经5μg/ml的吖啶橙处理后,细胞分裂生长速度减慢,细胞表面粗糙,微核发生率为10.4‰,10μg/ml时可引起细胞膜破碎或死亡,微核发生率为22‰,出现三核,多核甚至核裂现象。当AcMNPV经吖啶橙处理后再感染sf9细胞,AcMNPV可在细胞内增殖,形成多角体,并出现一些类似三角形或四角形的异常多角体。结论:用一定剂量的吖啶橙处理草地贪夜蛾sf9细胞和AcMNPV病毒,可对细胞产生损伤和引起AcMNPV发生异常多角体。

不同杀虫成分对Sf9细胞凋亡的影响

通过倒置显微形态观察凋亡小体、DNA琼脂糖凝胶电泳确证的模型,研究了8种代表性杀虫成分对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体培养细胞系Sf9的凋亡诱导效果,以探讨不同杀虫成分对昆虫细胞凋亡的影响.结果表明,印楝素0.15-1.50μg/mL处理后72 h内、喜树碱0.35-3.50μg/mL处理后36 h,Sf9细胞产生大量典型凋亡小体,处理时间延长或剂量加大则以造成细胞坏死为主;DNA电泳产生典型的DNA Ladder,表明印楝素和喜树碱对Sf9具有明显的细胞凋亡诱导作用.印楝素1.5μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后24-48 h,喜树碱0.35-3.50μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后12 h.苦参碱、氟铃脲、毒死蜱、灭多威、氯氰菊酯以0.1-10.0μg/mL及昆虫蜕皮激素20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone）以0.048-4.800μg/mL处理后72 h内对Sf9均无明显的细胞凋亡诱导作用.杀虫剂对昆虫细胞凋亡诱导效应随供试化合物、细胞种类、处理剂量、处理时间而异.

RSV编码的4种蛋白在“AcMNPV-sf9昆虫细胞”体系中的重组表达

应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的4个基因NS2、NS3、CP和SP,并将它们克隆至pMD-18-T载体上.得到的重组质粒pMD-18-T-NS2、pMD-18-T-NS3、pMD-18-T-CP和pMD-18-T-SP经XbaⅠ/HindⅢ双酶切,分别与经相同方法酶切的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california nuclear polyhedrosis virus,AcM-NPV)转移载体pFastBacHTb相连接,构建重组转移质粒pFastBacHTb-X(pFastBacHTb-NS2、pFastBacHTb-NS3、pFastBacHTb-CP和pFastBacHTb-SP).序列测定表明,目的基因准确地插入到表达载体中.重组质粒pFastBacHTb-X通过转化包含有穿梭载体的大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH10Bac,得到重组穿梭质粒rb-X(rb-NS2、rb-NS3、rb-CP和rb-SP).rb-X侵染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)离体细胞(sf9)24-72 h后,在荧光倒置显微镜可见光200倍视野下观察到细胞增大、培养液和细胞内出现颗粒状物质、部分细胞破裂甚至裂解等一系列与正常sf9细胞形态有明显区别的现象.rb-X侵染细胞72h后,从细胞提取蛋白,电泳分析得到4个条带,大小分别为28.2、29.2、40.2和25.2 ku,与预测的4种融合蛋白大小一致.Western blotting分析分别得到4条单一条带,证明了RSV NS2、NS3、CP和SP基因在"AcMNPV-sf9昆虫细胞"真核表达体系中成功表达.

不同脊髓灰质炎病毒株3CD蛋白酶在昆虫细胞中的表达及其对P1前体蛋白的剪切

目的获得在昆虫细胞中有效表达脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因的重组杆状病毒,为制备脊髓灰质炎病毒样颗粒疫苗提供了科学依据。方法将I型脊髓灰质炎病毒(Mahoney株)的P1基因和3CD基因构建到供体质粒中,通过flash BAC ULTRATM系统制备重组杆状病毒;将Mahoney株的P1基因与Sabin株Ⅲ型的3CD基因组合,用同样方法构建重组杆状病毒。通过接种昆虫细胞草地贪夜蛾细胞(sf-9细胞)对两种病毒进行扩增,再接种昆虫细胞粉纹夜蛾细胞(High five细胞)扩大培养,并通过定量PCR对P1和3CD基因的表达进行验证,利用Western blot检测P1蛋白的表达及被3CD蛋白酶剪切的情况。结果获得了两株稳定表达脊髓灰质炎病毒P1和3CD基因的重组杆状病毒。其中,重组杆状病毒(Bac U-Mahoney-P1-3CD)在感染细胞后,3CD蛋白酶表达量较低,不能有效剪切P1前体蛋白;而重组杆状病毒(Bac U-Mahoney-P1-Sabin PV3 3CD)感染细胞后,3CD蛋白酶的表达量和对P1前体蛋白的剪切效力都有明显提高(P<0.05)。结论将Mahoney株P1基因和Sabin株Ⅲ型的3CD基因的组合构建重组杆状病毒,可有效地在昆虫细胞中表达P1和3CD基因,并且Sabin株Ⅲ型的3CD蛋白酶可有效地剪切Mahoney株的P1前体蛋白。

重组hIL-12病毒在Sf9细胞传代中遗传稳定性的研究

将含重组白细胞介素12(hIL-12)的杆状病毒(Ac-hIL12)经空斑纯化后,在草地贪夜蛾Sf9细胞中进行连续无稀释传代到P55代,收集被P15、P25、P35、P45、P55代重组病毒感染的细胞,抽提胞内病毒(ICV)DNA。根据重组病毒构建的原理,在P35 cDNA和P40 cDNA的3茨┒紊杓埔欢砸锝蠵CR,扩增出了包括P35 cDNA、Polyhedrin启动子、P10启动子和P40 cDNA序列在内的全长约2.0kb片段,克隆至T Vector进行序列测定后发现,在第P15、P25和P35代所扩增出的序列没有发生任何突变。但在P45代,P35cDNA中就有3个碱基发生了点突变(461T C,517A G以及630C T),Polyhedrin启动子的+1位后插入了一个碱基T,P40 cDNA与P10启动子区(230bp)没有变化;而第P55代除了以上碱基突变以外,P10启动子区-168位的G替换突变为T, -136与-135位之间插入一个碱基T,以及-122位缺失一个碱基T。以上结果表明杆状病毒在体外细胞连续传代过程中可导致外源基因本身的突变。

重组杆状病毒AcMNPV-PK2-RFP诱导Sf9细胞凋亡的机制分析

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒是一种模式杆状病毒,在农业虫害防治中广泛应用。其表达的PK2蛋白可以通过竞争性的与宿主细胞e IF2α激酶结合形成异源二聚体,抑制其磷酸化e IF2α,从而加速病毒增殖、诱导细胞凋亡。为了探讨PK2诱导宿主Sf9细胞凋亡的机制,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了重组杆状病毒AcMNPV-PK2-RFP。Western blot分析结果表明,重组病毒AcMNPV-PK2-RFP处理组在病毒侵染后48,60,72 h,宿主细胞内凋亡因子SfP53蛋白的表达量显著高于AcMNPV处理组,分别是AcMNPV处理组的1.16倍、1.39倍和1.79倍;在病毒侵染后48,72 h,AcMNPV-PK2-RFP处理组反映线粒体膜电位的绿色荧光分别是野生处理组的1.54倍和1.89倍,表明AcMNPV-PK2-RFP处理组的线粒体膜电位显著低于野生病毒处理组;同时,观察到AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体中的细胞色素c从病毒侵染后12 h开始释放。结果说明,过表达PK2的重组病毒AcMNPV-PK2-RFP可在感染后期加速SfP53蛋白的表达,通过影响线粒体凋亡信号通路加速宿主Sf9细胞的凋亡,同时表明重组病毒AcMNPV-PK2-RFP是一种相比野生型病毒抗虫活性更高的杀虫剂。

杆状病毒AcMNPV中Ac109蛋白的抗虫功能分析

为研究苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中病毒增殖因子Ac109对鳞翅目害虫甜菜夜蛾幼虫的抗虫效应,采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了重组病毒AcMNPV-Ac109-EGFP。免疫印迹和荧光显微镜观察结果证实,重组病毒AcMNPV-Ac109-EGFP侵染昆虫Sf9细胞后Ac109的表达量和细胞的荧光强度随着侵染时间延长而显著增加。抗虫试验表明,与AcMNPV处理组、PBS对照组相比,AcMNPV-Ac109-EGFP病毒处理组的幼虫体质量增长缓慢,有较高的致死率和低的蛹化率及羽化率;AcMNPV与AcMNPV-Ac109-EGFP病毒处理组的最终死亡率分别为58.33%和73.33%;蛹化率分别为41.667%和25.000%;羽化率分别为20.00%和11.67%,说明Ac109可提高病毒对甜菜夜蛾幼虫的抗虫性。以上结果构建了1株高抗虫活性的重组病毒,并为这个重组病毒潜在的应用价值提供了试验依据。