草苷膦抗性新基因的克隆、序列分析及其蛋白高级结构预测

利用错误倾向PCR(error-prone PCR)突变技术,以可变盐单胞菌(Halomonas variabilis)HTG7的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶基因为模板进行随机PCR扩增,得到目的基因片段(约1·35kb).将该基因片段与pACYC184载体连接后转化EPSP合酶缺陷型菌株大肠杆菌ER2799.利用功能互补筛选法得到了2株不具有草苷膦抗性的EPSP合酶阳性克隆突变株,记为Pmu1和Pmu2.序列分析表明,突变体Pum1的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有2处发生突变,导致氨基酸残基1处发生了改变;突变体Pmu2的EPSP合酶编码区与突变前基因相比,核苷酸有5处发生突变,导致氨基酸残基2处发生了改变.对突变前后EPSP合酶进行比较预测发现,其三级结构及蛋白中心骨架是大致相同的,但突变前后氨基酸位点肽平面和Cα相连的N键之间形成的扭转角度存在一定的差别.这些结果表明,酶的功能主要由蛋白的构象决定,二肽链形成后肽平面和N键之间角度的变化,造成高级结构构象细微的差别,致使草苷膦抗性功能丢失.

极端污染环境下草苷膦抗性菌株HTG7的筛选及其特性研究

从被草苷膦极度污染的土壤中分离到一株极端抗草苷膦菌HTG7,经初步鉴定其为可变盐单胞菌 (Halomonasvarabilis) ,该菌株最高可以耐受 5 0 0mmol L左右的草苷膦浓度。电镜观察表明 ,5 5 0mmol L的草苷膦浓度下 ,细胞大量坏死。生理生化特性表明该菌最适pH为 7 0 ,并且在氯化钠浓度 0～ 1 0 %生长良好。

用体外定向进化的方法对EPSPS合酶基因草苷膦抗性机制的研究

为了寻找EPSP合酶中某些与草苷膦抗性相关的位点,利用体外定向进化技术,对可变盐单胞菌HT7的EPSP合酶基因,荧光假单胞菌G2的EPSP合酶基因以及按植物偏爱密码子合成G2的EPSP合酶基因,进行DNA shuffling,通过EPSP合酶缺陷型菌株E.coilER2799的功能互补筛选,获得了7个草苷膦抗性有较大变化的EPSP合酶突变体.

转基因抗草苷膦大豆对大鼠生理代谢的影响及外源基因水平转移研究

为了分析转抗草甘膦转基因大豆对大鼠生理代谢水平的影响及其内源和外源基因遗传转移的情况，选用32只SD大鼠，随机分成2组，分别饲喂含30％转基因抗草苷膦豆粕和含30％非转基因豆粕的大鼠配合饲料，连续饲喂30d。试验结果表明，与对照组相比，试验组大鼠体重，血清中尿素氮（SUN）、葡萄糖、天冬氨酸转氨酶（CPT）和血清总胆固醇均无显著差异（P〉0．05）。同时，利用定性PER方法检测试验大鼠的血液、肌肉、肝脏、胰脏、肾脏、胃及肠道内容物中的转基因豆粕内源基因和外源基因。结果表明，在用含转基因豆粕的饲料饲喂的大鼠胃、肠道内容物中发现了转基因豆粕的内源基闲和外源基因片段，而在其血液及各组织器官中则没有发现，说明短期内转基因豆粕的内源和外源基因在大鼠体内没有发生遗传转移。