草酰乙酸和苹果酸对菠菜叶片和完整叶绿体光合作用的影响

观测了OAA和MA对菠菜叶片和完整叶绿体光合作用的影响。结果显示 ,当叶片切块在 2 0μmol/L 的OAA存在时 ,其叶片的光合放氧速率增加了 89% ,经OAA处理的离体完整叶绿体的光合放氧速率增加了 72 % ;当反应体系中存在有较高浓度的NaHCO3时 ,OAA的作用不明显。叶片经 2 0 μmol/L的MA处理后 ,叶片光合放氧速率比对照高 12 7%。用CO2 分析仪观测了处理后叶片的净光合速率 (Pn) ,结果显示 ,OAA和MA处理后的叶片Pn值分别是对照的 117%和 111%。对在C3植物中建立C4微循环系统来提高光合作用效率的可能性进行了讨论。

菠萝叶片PEP羧激酶活性及草酰乙酸与腺苷酸库的昼夜变化

自然条件下生长的菠萝植株，其叶片的ＰＥＰ羧激酶的脱羧与可逆羧化活性于中午１２时达最大值。脱羧／羧化比值在上午明显高于下午和晚上。脱羧反应底物ＯＡＡ含量于夜间增高，至次日早晨６时最高，随后下降。白天的ＯＡＡ／Ｍａｌ值高于夜间。参与Ｍａｌ及ＯＡＡ形成转化的ＰＥＰＣ和ＭＤＨ活性的昼夜变化与ＰＥＰ羧激酶（ＰＥＰＣＫ）活性的图式相似。ＰＥＰ羧激酶脱羧反应的另一底物ＡＴＰ在夜间０～６时内处于低水平，白天９～１５时内则显著增高。

草酰乙酸对锂-匹罗卡品癫痫大鼠的神经保护作用

目的观察静脉注射草酰乙酸(oxaloacetate,OxAc)对氯化锂-匹罗卡品癫痫(lithium-pilocarpine seizures,LPS)模型大鼠的神经保护作用。方法 30只6～8周龄、体质量180～220 g的Sprague-Dawley雄性大鼠按随机数字表法分为5组:生理盐水对照组(用0.9%生理盐水代替匹罗卡品)、LPS模型对照组、LPS+OxAc组(癫痫持续状态终止时注射OxAc 3.5 mg/100 g)、LPS+OxAc+谷草转氨酶(glutamate-oxaloacetate transminase,GOT)组(癫痫持续状态终止时注射OxAc 3.5 mg/100 g+GOT 3.5μg/100 g)及LPS+OxAc+马来酸盐(Maleate)组(癫痫持续状态终止时注射OxAc3.5 mg/100 g+Maleate 6.3 mg/100 g)(n=6)。用氯化锂和匹罗卡品制备癫痫动物模型,诱发癫痫持续状态(status epi-lepticus,SE)60 min后注射安定终止发作。分别检测SE终止后不同时间点各实验组大鼠脑脊液与血液中的谷氨酸浓度、脑电图表现及神经元脱失情况。结果 LPS模型对照组大鼠SE终止后脑脊液与血液中的谷氨酸浓度显著升高,8 h左右达到最高峰,与生理盐水对照组相比,分别升高了约88%和54%,随后开始缓慢下降。在SE终止后静脉注射OxAc可以在8 h内明显降低癫痫大鼠脑脊液中的谷氨酸浓度(P<0.05),8 h后其作用基本消失;OxAc对癫痫大鼠血液中谷氨酸浓度的降低作用可以持续至注射后12 h(P<0.05)。OxAc对癫痫大鼠脑电图表现及海马、齿状回门区神经元脱失现象也有明显改善作用。在应用OxAc的同时,静脉注射GOT可以增强OxAc对LPS大鼠的神经保护作用,而同时应用GOT特异性抑制剂Maleate可以减弱OxAc的上述作用效果。结论静脉注射OxAc可通过促使血液中谷氨酸浓度下降而对氯化锂-匹罗卡品癫痫模型大鼠的神经起到保护作用。

钠代草酰乙酸乙酯的合成及与苯肼的反应

以乙酸乙酯和草酸二乙酯为原料 ,经交叉Claisen酯缩合反应合成钠代草酰乙酸乙酯 .讨论反应时间、碱的浓度、原料配比对反应的影响 .得出较佳工艺条件为∶n(乙醇钠 )∶n(乙酸乙酯 )∶n(草酸二乙酯 ) =1 .0 2∶1 .0 2∶1 .0 0 ,乙醇钠浓度为 1 9.5 % ,反应时间为 4h ,产率为 76% .用此盐与苯肼在酸性条件下进行加成缩合反应可制得 1 苯基 3 羧酸乙酯 5 吡唑啉酮 .产物的结构经红外光谱分析确认 .

偶联钠离子转运草酰乙酸脱羧酶研究进展

偶联钠离子转运草酰乙酸脱羧酶是第一个被发现具有初级钠离子泵活性脱羧酶家族成员,由α,β,γ三个亚基以及生物素组成。由于其脱羧反应对柠檬酸发酵途径具有关键作用,并且在脱羧过程中偶联钠离子输出,该酶已受到学术界广泛关注。目前,该酶已在包括克雷伯菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)和弧菌属(Vibrio)等多个属细菌中被发现,并且其生理学基本特征已被鉴定。在肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)中,该酶中参与偶联脱羧反应钠离子输出重要氨基酸活性位点通过拓扑学分析、定点突变等方法被深入地进行鉴定,在此基础上能量偶联模型被提出以解释该酶偶联钠离子输出脱羧反应机制。本文对以上研究进展进行综述并对该酶未来研究方向加以展望。

草酰乙酸—苹果酸穿梭系统对甘氨酸和α-酮戊二酸氧化的调节

草酰乙酸—苹果酸穿梭系统通过改变线粒体基质内NAD^+的可利用量或NADH/NAD^+比率对甘氨酸和α-酮戊二酸氧化进行调节。该穿梭系统利用不同来源的NADH的能力相近。

沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶在大肠杆菌中的表达、纯化及其生化鉴定

为深入了解沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶的生化特性及功能,将该酶基因克隆到表达载体中,转入大肠杆菌中诱导表达,表达产物经monomeric avidin-Sepharose亲和层析分离纯化,获得了纯的沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶。结果表明:纯化后的草酰乙酸脱羧酶经SDS-PAGE检测,呈现3条蛋白谱带,相对分子质量分别为65×103、46×103、8.8×103左右;该酶不耐高温,50℃温浴1h后活力几乎完全丧失;其最适pH为6.0左右;1mmol·L-1Zn2+、0.5mmol·L-1草酸和20mmol·L-1丙酮酸几乎完全抑制该酶的活力,10～20mmol·L-1NaCl对该酶有明显激活作用,但200～500mmol·L-1的NaCl对该酶却有明显抑制作用。

香菇草酰乙酸水解酶基因LeOAH1克隆及表达分析

草酰乙酸水解酶(Oxaloacetate acetylhydrolase/Oxaloacetate hydrolase)是香菇(Lentinula edodes)中草酸合成的关键性酶,克隆香菇LeOAH1,并分析其在香菇体内与体外的表达情况,旨为研究香菇LeOAH1的功能奠定基础。从香菇L808中克隆LeOAH1,并进行生物信息学分析,采用RT-PCR和高效液相技术检测LeOAH1在不同pH条件下香菇菌丝内的表达情况和草酸含量。此外,构建了重组原核表达载体pET28a-oah1,在大肠杆菌中进行体外表达。基因克隆结果表明,该基因的gDNA长度为1906 bp,cDNA长度为1356 bp,编码氨基酸数量为451个,蛋白分子质量约为48.9 kD,等电点为6.80。生物信息学分析表明:该酶为不稳定的疏水性蛋白,具有α-螺旋(40.08%)、无规则卷曲(34.59%)、延伸链(17.52%)、β-折叠(7.10%)4种二级结构;亚细胞定位在细胞质中;序列比对的结果显示该酶有保守结构域;系统发育树分析该蛋白,与日本香菇OAH的相似度最高,同源性为82%;其次是灰光柄菇,同源性为64%。RT-PCR、HPLC的结果显示:在不同pH条件下,随着pH增加,LeOAH1基因表达量增加,香菇草酸分泌量也随之增加。而大肠杆菌中诱导表达的蛋白分子量符合预测结果。初步明确了香菇草酰乙酸水解酶的基因特性以及表达规律,以及与草酸分泌的关系。

指状青霉草酰乙酸水解酶的结构特征与原核表达分析

利用生物信息学技术手段分析了柑橘绿霉病病原菌指状青霉(Penicillium digitatum)中草酰乙酸水解酶(Pd OAH)的二级和三级结构,并利用分子生物学技术对重组的Pd OAH进行了原核表达分析和分离纯化。生物信息学分析结果表明Pd OAH的建模结构的质量较高,与其它来源的草酰乙酸水解酶的氨基酸序列具有高度的同源性,且在活性中心氨基酸残基高度保守。重组Pd OAH蛋白在大肠杆菌中进行原核表达,在16℃、0.2 mmol/L IPTG浓度条件下具有较高的表达量,并且有一定的可溶性。利用亲和层析技术分离纯化方法获得了纯度较高的重组Pd OAH蛋白。

谷氨酸草酰乙酸转氨酶抑制脑损伤后炎症反应的研究

目的研究颅脑损伤(TBI)大鼠模型脑组织中炎性细胞因子(TNF-α、IL-6)的时间依从性变化,并探讨谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)干预后的影响。方法随机选取健康成年雄性SD大鼠,应用随机数字表法分为假手术组(Sham组)、颅脑损伤组(TBI组)及TBI+谷氨酸草酰乙酸转氨酶处理组(TBI+GOT组),采用改良FeeneyDM自由落体撞击法制备TBI模型,Sham组开颅窗后不予以撞击;TBI+GOT组于制模前经颈部皮下注射GOT1周;分别于模型制作成功后12h、1d、3d、5d处死大鼠,制备脑组织匀浆,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的表达情况。结果与Sham组比较,TBI组和TBI+GOT组脑组织TNF-α和IL-6的浓度在脑损伤后12h、24h显著升高(P<0.05),第3、5天无显著变化;与TBI组比较,TBI+GOT组脑组织TNF-α和IL-6的浓度在脑损伤后12h、24h显著降低(P<0.05),第3、5天无显著变化。结论颅脑损伤后脑组织炎性细胞因子(TNF-α、IL-6)的释放具有时间依从性,谷氨酸草酰乙酸转氨酶处理后炎性因子的释放受到抑制。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶介导的草酰乙酸回补途径对谷氨酸棒杆菌V1氨基酸代谢的影响

【目的】谷氨酸棒杆菌是工业生产氨基酸的主要菌株,以缬氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌V1为研究对象,探讨磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)介导的草酰乙酸回补途径对菌株生理特性以及主要氨基酸代谢流量的影响。【方法】通过基因工程手段,在谷氨酸棒杆菌V1中过表达pepc(编码PEPC)和pck(编码PCK),比较重组菌与出发菌关键酶活性、发酵特性以及主要氨基酸积累量变化。【结果】构建两株重组菌V1-pepc(强化草酰乙酸回补途径)和V1-pck(弱化草酰乙酸回补途径),重组菌生长均较出发菌延缓,总生物量、葡萄糖和硫酸铵消耗基本不变;过表达pck,PCK活性提高22.8%,丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、精氨酸积累量分别提高了11.8%、17.2%、27.8%和19.5%;过表达pepc,PEPC活性提高27.5%,同时PC活性降低12.9%,天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸的整体流量变化不大,丙氨酸族氨基酸的整体流量降低了14.7%。【结论】丙氨酸族氨基酸受此回补途径影响较大,天冬氨酸族氨基酸受此影响较小。

小鼠中度颅脑创伤急性期激活腺苷A2A受体强化草酰乙酸的神经保护作用

本文旨在探讨联合应用谷氨酸清除剂草酰乙酸(oxaloacetate,OA)和腺苷A2A受体(adenosine A2A receptor,A2AR)激动剂CGS21680在中度颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)急性期中的神经保护作用和机制。使用C57BL/6J小鼠建立中度TBI模型,伤后急性期分别单纯使用OA、CGS21680或联合使用OA和CGS21680,伤后24 h检测神经功能评分、脑含水量、脑脊液谷氨酸浓度、脑组织IL-1β和TNF-α水平、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(glutamate oxaloacetate aminotransferase,GOT)水平和活性及ATP浓度。结果表明,与TBI组相比,单纯使用CGS21680加重脑损伤,包括加重神经功能缺损、提高脑含水量、脑脊液谷氨酸水平和促进神经炎症;单纯使用OA可以抑制脑脊液谷氨酸水平和脑含水量的升高,并提高脑组织ATP浓度;联合使用OA和CGS21680改善了神经功能评分,降低了脑含水量、脑脊液谷氨酸浓度以及脑组织IL-1β和TNF-α的mRNA含量和蛋白水平,增加了ATP水平,且效果优于单纯使用OA组。此外,单纯使用CGS21680提高了脑组织GOT活性,早期联合使用OA和CGS21680提高了脑组织GOT的mRNA水平和活性,提示激活A2AR可提高GOT效能,促进OA代谢谷氨酸的能力,这可能是联合用药组A2AR激活不仅没有加重损伤,反而强化OA神经保护作用的机制。本研究为A2AR激动剂和OA运用于TBI临床治疗提供了新的思路。

草酰乙酸对酿酒酵母荔枝酒发酵中醋酸代谢的影响

以能同时利用可发酵性糖和乙酸的酿酒酵母为出发菌株,研究荔枝酒酿造过程中添加不同浓度的草酰乙酸(OAA)对酿酒酵母代谢醋酸的影响。结果表明:添加OAA对酿酒酵母代谢醋酸具有显著影响。添加OAA促使酿酒酵母表达较高的丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)及乙酰辅酶A合成酶(ACS)的酶活性,产生较多的酒精和乙醛以及较少的琥珀酸、苹果酸和甘油,提高了酿酒酵母代谢醋酸的能力。添加0.8 g/L的OAA,酿酒酵母代谢醋酸的量比对照提高了60 mg/L。

草酰乙酸对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

目的 探索草酰乙酸对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用。方法 将60只体重200~250 g雄性大鼠随机分为6组：阴性对照组、假手术组、模型组、草酰乙酸预处理后心肌缺血-再灌注（OAA）模型组（三个亚组：高,中,低剂量组）。建立大鼠心肌缺血再灌注模型,造模期间记录左心室内压（LVSP）,左心室内压最大变化速率（±dp/dt_（max））以及左心室舒张期末压力（LVEDP）,左冠状动脉前降支结扎30 min后实现再灌注180 min后采血,测定肌钙蛋白Ⅰ（c Tn-Ⅰ）,乳酸脱氢酶（LDH）,超氧化物歧化酶（SOD）,谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。取心脏组织,染色,计算梗死范围。使用WB方法检测心肌标本的NF-E2相关因子2（Nrf2）、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）及Nrf2下游的血红素氧合酶1（HO-1）的表达。结果 与假手术组比较,阴性对照组各项指标差异均无统计学意义（P〉0.05）;而模型组血清SOD、GSH-Px活力显著降低（P〈0.01）,血清LDH、c Tn-I含量显著升高（P〈0.01）,心肌组织梗死面积显著升高（P〈0.01）;与模型组相比,草酰乙酸预处理组血清SOD、GSH-Px活力显著升高（P〈0.05）,LDH、c Tn I含量显著降低（P〈0.05）,心肌组织梗死面积显著降低（P〈0.05）,其中高剂量组上述各项指标改变更加明显,差异有统计学意义（P〈0.01）;与模型组相比,OAA预处理组的Keap1显著下调（P〈0.001）,总Nrf2表达增加,并且Nrf2的核转移及下游HO-1表达显著上调（P〈0.001）,提示草酰乙酸可通过（至少部分可通过）Keap1-Nrf2通路减少缺血再灌注氧化应激损伤,减轻心肌损害,起到心肌保护作用。结论 草酰乙酸可通过Keap1-Nrf2通路减少缺血再灌注氧化应激损伤,对心肌缺血-再灌注损伤具有保护作用。

靶向抑制GOT1介导的铁死亡途径逆转食管鳞癌细胞顺铂耐药的机制

目的:探究靶向抑制谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(GOT1)是否通过介导铁死亡途径影响食管鳞癌细胞顺铂(DDP)耐药性,并探究分子机制。方法:CCK-8法和细胞集落形成实验检测DDP敏感细胞株Eca-109与DDP耐药细胞株Eca-109/DDP的存活率、集落形成数目,RT-qPCR和Western blot检测Eca-109细胞和Eca-109/DDP细胞中GOT1表达水平差异;将Eca-109/DDP细胞分为对照组、siNC组、siGOT1组、siGOT1+铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)组,CCK-8法检测不同浓度DDP处理下各组细胞存活率,细胞集落形成实验检测各组细胞集落形成数目,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,DCFH-DA染色法检测各组细胞内活性氧(ROS)水平,比色法检测各组细胞中铁离子(Fe2+)浓度,Western blot检测各组细胞中铁死亡效应因子酰基辅酶A合成酶长链家族成员4 (ACSL4)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)的蛋白表达水平。结果:与Eca-109细胞比较,不同浓度DDP处理下Eca-109/DDP细胞存活率增高(P<0.05),细胞集落形成数目增加(P<0.05),细胞中GOT1 mRNA与蛋白相对表达量上调(P<0.05)。与对照组比较,siGOT1组Eca-109/DDP细胞在不同浓度DDP处理下的存活率降低(P<0.05),细胞集落形成数目减少(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),细胞中ROS水平和Fe2+浓度升高(P<0.05),ACSL4蛋白相对表达量上调(P<0.05),GPX4和SLC7A11蛋白相对表达量下调(P<0.05);与siGOT1组比较,siGOT1+Fer-1组Eca-109/DDP细胞在不同浓度DDP处理下的存活率升高(P<0.05),细胞集落形成数目增加(P<0.05),细胞凋亡率减少(P<0.05),同时,细胞中ROS水平和Fe2+浓度降低(P<0.05),ACSL4蛋白相对表达量下调而GPX4和SLC7A11蛋白相对表达量上调(P<0.05)。结论:靶向抑制GOT1能够提高食管鳞癌耐药细胞Eca-109/DDP对DDP的敏感性,促进该耐药细胞凋亡,这一作用与促进铁死亡途径有关。

寄主诱导的基因沉默干扰核盘菌致病基因OAH在甘蓝型油菜抗菌核病中的应用

油菜是我国第一大油料作物,菌核病是我国油菜面临的主要病害之一。本试验利用HIGS技术将核盘菌中关键致病基因SS1G_08218(OAH)的干扰片段转化到甘蓝型油菜中,获得含有siRNA的转基因油菜植株,研究HIGS介导的SsOAH基因沉默对油菜抗菌核病的影响。接种核盘菌后的抗病鉴定结果表明,SS.OAH.RNAi转基因油菜植株对核盘菌抗性增强;R18、R25和R36株系叶片接菌后病斑部位核盘菌菌丝内的OAH基因表达量均低于野生型,证明siRNA在转基因油菜中成功表达;在添加了转基因油菜叶片提取物的培养基上培养的核盘菌扩展面积显著小于野生型,分别降低35.29%、21.98%、31.53%,且菌丝生长显著迟缓,扩展长度较短,分支少,生长过程中发生断裂,生长异常,将其接种于正常的野生型油菜后,其致病力明显下降;对转基因油菜叶片接种核盘菌后观察发现,叶片上的菌丝扩展较为稀疏,生长受阻,侵染垫形成受到抑制,暗示在油菜中表达OAH基因的干扰片段影响了菌丝生长和扩展;进一步检测其病斑组织中的草酸含量发现,接菌36 h、48 h后转基因油菜病斑组织中的草酸含量为391μg g^(-1)、446μg g^(-1),与野生型相比分别减少54μg g^(-1)、32μg g^(-1)。这一研究表明在油菜中表达核盘菌OAH的干扰片段能够降低核盘菌侵染时草酸的积累,从而增强转基因油菜对核盘菌的抗性水平。本试验利用HIGS技术研究了干扰核盘菌关键致病基因OAH增强油菜对核盘菌的抗性,为选育油菜抗菌核病品种提供理论基础和种质资源。

生物素和VB_1在谷氨酸棒杆菌过量合成缬氨酸中的作用

通过对谷氨酸棒杆菌突变株AATV341进行生物素和VB1添加量的实验,探讨了生物素和VB1添加量对该菌株菌体质量及缬氨酸产量的影响;同时根据对AATV341进行的胞内外某些特定氨基酸和有机酸检测,研究了这两种维生素对碳架代谢流的分布,尤其是对丙酮酸节点处的代谢流量分布的影响.结果表明,生物素添加量在40μg/L时,菌体质量和缬氨酸在胞外的累积明显提高,谷氨酸在胞外累积降低;VB1的适量添加,可提高缬氨酸在胞外的累积,降低发酵液中乙酸和草酰乙酸的含量.

添加TCA循环中间产物加速光滑球拟酵母积累丙酮酸

在维生素限制的条件下 ,研究了添加TCA循环中间产物对光滑球拟酵母多重维生素营养缺陷型菌株CCTCCM2 0 2 0 19生长和积累丙酮酸的影响。该菌株能以TCA循环中间产物为唯一碳源进行生长 ,且在以葡萄糖、乙酸和TCA循环中间产物为复合碳源的平板上菌落数高于分别以葡萄糖和乙酸或TCA循环中间产物为唯一碳源时的菌落数。与其它TCA循环中间产物相比 ,草酰乙酸更能促进细胞的生长、提高丙酮酸产量和对葡萄糖的得率。草酰乙酸能够促进细胞生长 ,是因为T .glabrataCCTCCM2 0 2 0 19菌株能够利用乙酸作为乙酰辅酶A供体。在含有10 0g L葡萄糖和 6g L乙酸钠的培养基中再添加 10g L草酰乙酸进行分批发酵实验 ,可使菌体浓度从 11 8g L提高到 13 6g L ,增长幅度为 15 % ;丙酮酸对葡萄糖的得率 (0 6 6g g)以及生产强度 (1 19g·L- 1 ·h- 1 )分别高出 6 %和2 4 % ,使发酵结束时间提前 8～ 12h。

转玉米C_4光合酶基因水稻株系中的光合C_4微循环

用转PEPC、PPDK、NADP ME、PEPC +PPDK等酶基因的水稻株系及原种野生型 (WT)为材料 ,研究了不同基因型水稻叶片中的C4光合微循环及其功能。用外源OAA或MA饲喂叶切片或离体叶绿体后 ,光合放氧速率在野生型水稻中增加了 5 0 % ,在NADP ME 和PPDK 转基因水稻中增加了 5 0 %～ 5 4 % ,在PEPC 和PEPC +PPDK 转基因水稻中增加了10 0 %～ 15 0 %。证明原种水稻Kitaake叶片中具有一个原初的和有限的C4光合微循环 ,除PPDK基因、NADP ME基因外 ,外源PEPC基因或PEPC +PPDK双基因导入原种水稻Kitaake后 ,可大幅度提高C4光合微循环的运行。水稻中C4光合微循环的增强有降低光呼吸速率 (Pr)、增加净光合速率 (Pn)的作用 ,在光能利用上 ,可增加PSⅡ光化学效率 (Fv/Fm)、光化学猝灭 (qp)、降低非光化学猝灭 (qN)的作用 ;