香菇草酰乙酸水解酶基因LeOAH1克隆及表达分析

草酰乙酸水解酶(Oxaloacetate acetylhydrolase/Oxaloacetate hydrolase)是香菇(Lentinula edodes)中草酸合成的关键性酶,克隆香菇LeOAH1,并分析其在香菇体内与体外的表达情况,旨为研究香菇LeOAH1的功能奠定基础。从香菇L808中克隆LeOAH1,并进行生物信息学分析,采用RT-PCR和高效液相技术检测LeOAH1在不同pH条件下香菇菌丝内的表达情况和草酸含量。此外,构建了重组原核表达载体pET28a-oah1,在大肠杆菌中进行体外表达。基因克隆结果表明,该基因的gDNA长度为1906 bp,cDNA长度为1356 bp,编码氨基酸数量为451个,蛋白分子质量约为48.9 kD,等电点为6.80。生物信息学分析表明:该酶为不稳定的疏水性蛋白,具有α-螺旋(40.08%)、无规则卷曲(34.59%)、延伸链(17.52%)、β-折叠(7.10%)4种二级结构;亚细胞定位在细胞质中;序列比对的结果显示该酶有保守结构域;系统发育树分析该蛋白,与日本香菇OAH的相似度最高,同源性为82%;其次是灰光柄菇,同源性为64%。RT-PCR、HPLC的结果显示:在不同pH条件下,随着pH增加,LeOAH1基因表达量增加,香菇草酸分泌量也随之增加。而大肠杆菌中诱导表达的蛋白分子量符合预测结果。初步明确了香菇草酰乙酸水解酶的基因特性以及表达规律,以及与草酸分泌的关系。

指状青霉草酰乙酸水解酶的结构特征与原核表达分析

利用生物信息学技术手段分析了柑橘绿霉病病原菌指状青霉(Penicillium digitatum)中草酰乙酸水解酶(Pd OAH)的二级和三级结构,并利用分子生物学技术对重组的Pd OAH进行了原核表达分析和分离纯化。生物信息学分析结果表明Pd OAH的建模结构的质量较高,与其它来源的草酰乙酸水解酶的氨基酸序列具有高度的同源性,且在活性中心氨基酸残基高度保守。重组Pd OAH蛋白在大肠杆菌中进行原核表达,在16℃、0.2 mmol/L IPTG浓度条件下具有较高的表达量,并且有一定的可溶性。利用亲和层析技术分离纯化方法获得了纯度较高的重组Pd OAH蛋白。

寄主诱导的基因沉默干扰核盘菌致病基因OAH在甘蓝型油菜抗菌核病中的应用

油菜是我国第一大油料作物,菌核病是我国油菜面临的主要病害之一。本试验利用HIGS技术将核盘菌中关键致病基因SS1G_08218(OAH)的干扰片段转化到甘蓝型油菜中,获得含有siRNA的转基因油菜植株,研究HIGS介导的SsOAH基因沉默对油菜抗菌核病的影响。接种核盘菌后的抗病鉴定结果表明,SS.OAH.RNAi转基因油菜植株对核盘菌抗性增强;R18、R25和R36株系叶片接菌后病斑部位核盘菌菌丝内的OAH基因表达量均低于野生型,证明siRNA在转基因油菜中成功表达;在添加了转基因油菜叶片提取物的培养基上培养的核盘菌扩展面积显著小于野生型,分别降低35.29%、21.98%、31.53%,且菌丝生长显著迟缓,扩展长度较短,分支少,生长过程中发生断裂,生长异常,将其接种于正常的野生型油菜后,其致病力明显下降;对转基因油菜叶片接种核盘菌后观察发现,叶片上的菌丝扩展较为稀疏,生长受阻,侵染垫形成受到抑制,暗示在油菜中表达OAH基因的干扰片段影响了菌丝生长和扩展;进一步检测其病斑组织中的草酸含量发现,接菌36 h、48 h后转基因油菜病斑组织中的草酸含量为391μg g^(-1)、446μg g^(-1),与野生型相比分别减少54μg g^(-1)、32μg g^(-1)。这一研究表明在油菜中表达核盘菌OAH的干扰片段能够降低核盘菌侵染时草酸的积累,从而增强转基因油菜对核盘菌的抗性水平。本试验利用HIGS技术研究了干扰核盘菌关键致病基因OAH增强油菜对核盘菌的抗性,为选育油菜抗菌核病品种提供理论基础和种质资源。