水蛭素-草酸二维生素E酯脂质体的构建及其体外抗凝作用评价

目的基于维生素E,构建同时具有过氧化氢清除功能和抗凝作用的脂质体,探讨其是否可以作为急性缺血性脑卒中的治疗方式并评价其体外抗凝作用。方法利用过氧草酸酯键将两分子维生素E(生育酚,VE)化学键合,得到目标化合物草酸二维生素E酯(oxalate vitamin E,OVE);通过酰胺化反应将抗凝药物水蛭素(hirudin)连接到亚油酸(linoleic acid,LA)得到抗凝目标单元亚油酸-水蛭素(LA-hirudin,LH);并通过红外光谱、核磁等手段对所合成的产物进行结构表征。采用薄膜分散法制备水蛭素-草酸二维生素E酯脂质体(hirudin-OVE liposome,HOL),采用激光粒度仪(DLS)和透射电子显微镜(TEM)等方法对脂质体进行表征。选取小鼠脑微血管内皮细胞(mouse brain-derived endothelial cells,bEnd3)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)进行细胞实验。通过ELISA测定过氧化氢以及细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平,以评价脂质体对细胞氧化应激和炎症水平的影响。采用细胞计数实验(CCK-8)和细胞增殖检测实验(Edu)考察脂质体对细胞数目和细胞增殖情况的影响。取小鼠全血,考察所制备脂质体的抗凝作用。结果核磁结果表明成功合成了OVE,红外谱图结果表明水蛭素和亚油酸成功键合得到亚油酸-水蛭素。透射电镜和激光粒度仪结果表明所制备的脂质体形状为类球形,且粒径分布均匀,平均粒径为161 nm。细胞实验表明,脂质体能够显著抑制模型细胞分泌过氧化氢和炎症因子,具有明显的抗氧化、抗炎作用(P<0.05)。细胞计数实验和细胞增殖检测实验结果证明脂质体能够抑制炎症导致的细胞数目减少、缓解LPS刺激所引起的细胞增殖抑制(P<0.01)。抗凝实验结果表明,脂质体能够显著抑制CaCl 2诱导的凝血反应(P<0.01)。结论基于维生素E成功合成过氧化氢清除性材料OVE,并以抗凝药物水蛭素和OVE制备OVE抗凝脂质体(HOL),该脂质体在细胞层面上具有良好的抗氧化、抗炎效果,并具有显著的抗凝作用。