表达产甲酸草酸杆菌草酸分解基因的人肝细胞系的构建

目的:构建表达产甲酸草酸杆菌(Ox.F)草酸分解基因的人肝细胞系,探索高草酸尿的治疗方法。方法:分离培养人肠道Ox.F并克隆其功能基因oxc和frc,构建同时表达oxc和frc的真核双表达载体质粒pIRES-oxc-frc,将pIRES-oxc-frc转染人正常肝细胞系L-02。用RT-PCR和Western blot技术了解转基因细胞的目的基因表达状况;用离子色谱法测定转基因后细胞培养液中草酸浓度,了解其草酸分解功能。结果:转基因后人肝细胞系L-02在mRNA和蛋白质水平均成功表达oxc和frc基因,其草酸分解功能较转染前明显增强(P<0.01)。结论:Ox.F分解草酸的两个重要功能基因oxc和frc能在体外转入人正常肝细胞(L-02)中,并使后者草酸分解能力明显增强。转草酸分解基因的人肝细胞系的构建,有望用于高草酸尿,尤其是PH的病因治疗,值得进一步研究。

产甲酸草酸杆菌细胞数群体感应系统基因hdtS克隆和功能分析

为鉴定产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)是否具有细胞数群体感应(QS)系统,将费氏弧菌(Vibrio fischeri)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorences)QS系统相关基因与产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)基因组序列进行比对,初步确定hdtS和AGPA为QS系统候选基因。通过PCR和T-A克隆方法分别克隆以上两个基因并将其构建成表达载体pET19-hdtS和pET19-AGPA,借助SDS-PAGE凝胶电泳证实以上两个基因均在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中高效表达,采用平板菌株报告法鉴定hdtS具有酰基高丝氨酸内酯(AHL)合成酶的功能,而AGPA则不具有该功能。这是国内外首次报道产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)中QS系统有关基因,对该菌株QS系统了解及分析影响该菌株在人肠道内定殖因素具有重要意义。

中国人肠道产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因的分离、克隆和鉴定

目的克隆产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因(frc),检测其在真核细胞中的表达。方法用聚合酶链式反应技术从产甲酸草酸杆菌基因组DNA中扩增frc基因片段并插入真核表达载体获取重组质粒pEGFP-frc,通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定重组质粒。重组质粒转染人胚肾293细胞,检测frc基因在mRNA和蛋白水平上的表达。被转染细胞在含草酸培养液中培养,检测0～72h培养液中草酸浓度的变化。结果frc基因的真核表达载体构建成功。转染293细胞后24～72h,可观察到明亮的绿色荧光,在mRNA和蛋白水平上可检测到frc基因在真核细胞中的表达。转染pEGFP-frc细胞12～72h培养液中草酸浓度明显低于转染空载体的细胞(P<0.05)。结论中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可分离出frc基因;frc基因可在真核细胞293细胞中表达并使293细胞获得代谢草酸的能力。

中国人肠道产甲酸草酸杆菌frc基因的分离及其在真核细胞中的表达

目的：探讨中国人肠道产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因（frc）的分离、克隆和鉴定。方法：提取中国人肠道产甲酸草酸杆菌的基因组DNA，利用PCR技术扩增frc基因片段并克隆入真核表达载体pEGFP—C1，重组质粒命名为pEGFP—frc，通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定插入片段。将pEGFP—frc通过脂质体转染293细胞，通过逆转录PCR（RT—PCR）和蛋白印迹（Western blot）分别从mRNA和蛋白水平检测frc基因在真核细胞中的表达。结果：中国人肠道产甲酸草酸杆菌fre基因全长1287bp，存在53个碱基和4个氨基酸残基的变异，与GenBank中的frc基因的碱基序列的同源性为95．88％，氨基酸残基序列的同源性为99．07％。转染293细胞后24-72h，可观察到明亮的绿色荧光，RT—PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平上检测到frc基因在真核细胞中的表达。结论：中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可以分离出frc基因；中国人肠道产甲酸草酸杆菌frc基因存在一定的变异；frc基因可在真核细胞293细胞中表达。

肠道食草酸杆菌与草酸钙尿石形成

肠道吸收草酸的量对于草酸钙结石的形成具有重要意义。近年从人类肠道中分离出的肠道食草酸杆菌,通过分解肠道中的草酸而调节肠道对草酸的吸收。本文综述了该菌的细菌学特征,生化代谢机理,与草酸代谢的关系等,为进一步研究尿石症的成因提出一个新的潜在的研究领域。

产甲酸草酸杆菌基因frc和OXC在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的:将产甲酸草酸杆菌(OXF)草酸分解基因frc和oxc分别克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-N1和pBaBE-puro,共转染正常成人骨髓间充质干细胞(hMSCs),使frc和oxc基因在hMSCs中稳定表。方法:以本实验室保存的OXF基因组为模板,PCR法扩增出frc和oxc基因的编码序列,采用逆转录病毒载体将frc和oxc导入hMSCs中,Q-PCR和Western blot检测其表达。结果:重组载体pLEGFP-N1-myc-frc、pBaBE-puro-flag-oxc构建成功;并检测出frc和oxc基因在hMSCs中的稳定表达。结论:逆转录病毒载体介导的frc和oxc能成功转染hMSCs,能为以后体外诱导分化为肝细胞,治疗内源性高草酸尿奠定基础,为下一步的实验提供原材料。

产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆及其蛋白结构预测

参考GenBank中已公布的产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes,OxB)的参考序列(M77128)设计了一对扩增OXC酶蛋白基因的引物,对产甲酸草酸杆菌(ATCC 35274)的DNA抽提物进行扩增,获得了特异性的扩增片段.运用Lnternet网络上的数据库及程序,对OXC酶蛋白的理化性质、结构和功能进行生物信息学分析.结果显示克隆序列与参考序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列的同源性达到99.9%和99.6%,预测该酶蛋白是分泌到胞外行使生物学功能的胞外酶,具有良好的抗原性和亲水性,二级结构是以α-螺旋为主的混合型蛋白而且其二级结构预测显示OXC酶蛋白属于硫胺素焦磷酸依赖酶家族,和其它酶家族成员一样能够发挥降解草酸的功能.

人肠道产甲酸草酸杆菌的分离培养

目的探讨产甲酸草酸杆菌分离培养及鉴定方法.方法应用选择性培养基,在37 ℃厌氧环境下分离培养人肠道产甲酸草酸杆菌.通过观察菌落形态、细菌涂片染色镜检、离子色谱仪及核酸序列分析,对细菌进行鉴定.结果产甲酸草酸杆菌菌落形态为白色点状或梭状,大小约(0.1～0.5) mm×(1.0～3.0) mm;菌落周边出现直径约3.5～4.5 mm的清晰透明圈.该细菌为革兰氏阴性杆菌,大小约(1.0～1.6) μm×(3.0～6.5) μm.液体培养基中草酸浓度随细菌浓度增加而逐渐下降.与文献报道核酸序列比较,该细菌分解草酸的功能基因frc、oxc的核酸同源性分别为95.8%及93.6%.结论产甲酸草酸杆菌可通过选择性培养基、在厌氧环境下从人粪便中分离出来.

产甲酸草酸杆菌预防草酸钙肾结石的作用

目的从健康志愿者新鲜粪便中筛选人源产甲酸草酸杆菌并研究其防治草酸钙结石的作用。方法从健康志愿者新鲜粪便中筛选并分离培养人源产甲酸草酸杆菌。采用0.8%乙二醇灌胃建立草酸钙结石大鼠模型。大鼠按随机数字表法分为对照组及4组乙二醇诱导的草酸钙结石模型组,其中3组草酸钙结石大鼠分别以10^6、10^7、10^8菌落形成单位(CFU)活菌干预4周。每周收集大鼠血及24 h尿液检测血钙、血镁、血磷、BUN、Scr、尿草酸、尿钙、尿镁、尿磷的变化。于第4周末处死大鼠,肾组织行HE、Yasue染色,偏折光镜下观察肾脏草酸钙结晶沉积部位及含量。结果分离出的菌株与已知美国模式菌种收集中心(ATCC)35274相似度为100%,由此判定已成功筛选出产甲酸草酸杆菌。第4周末5组大鼠间体重、Scr、BUN、血钙、血镁、血磷、尿镁、尿磷的差异均无统计学意义。第4周末造模组24 h尿钙排泄量显著低于对照组(P<0.05),经产甲酸草酸杆菌菌液干预后,10^8 CFU组24 h尿钙排泄量升高,显著高于造模组(P<0.05),其余干预组24 h尿钙排泄量与造模组差异无统计学意义。10^6 CFU组、10^7 CFU组尿草酸排泄量较造模组有所下降,但差异未达到统计学意义;10^8 CFU干预组在第1周末24 h尿草酸排泄量即显著低于造模组(P<0.05),且持续至第4周末。干预4周后,偏折光镜下对照组无结晶形成,造模组可见肾皮质和肾髓质内大量草酸钙结晶形成,结晶成堆分布,相互连接;Yasue染色与肾脏同一部位草酸钙结晶重合;与造模组相比,10^6 CFU组、10^7 CFU组草酸钙结晶评分无明显改变,而10^8 CFU组肾脏草酸钙结晶评分显著降低(P<0.05)。结论本研究已成功筛选出人源产甲酸草酸杆菌。每日给予10^8 CFU产甲酸草酸杆菌可安全、有效降低大鼠尿草酸排泄量,预防肾脏草酸钙结晶形成从而抑制结石形成。

中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的观察中国人肠道产甲酸草酸杆菌（Ox．F）草酰辅酶A脱羧酶基因（oxc）的分离、克隆及其在293细胞中的表达。方法提取中国人肠道Ox．F的基因组DNA，PCR扩增oxc基因片段并克隆人真核表达载体pEGFP—C1，通过限制性内切酶酶切电泳和测序鉴定基因片段。将重组质粒脂质体转染至293细胞，利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测oxc基因在真核细胞中的表达。结果中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因全长1707bp，与Gene Bank中的序列比较，碱基序列的同源性为93．61％，氨基酸残基序列的同源性为97．18％。重组质粒转染293细胞后24～48h，可观察到明亮的绿色荧光，从mRNA和蛋白水平上可以检测到oxc基因在真核细胞中的表达。结论中国人肠道产甲酸草酸杆菌中可以分离出oxc基因；中国人肠道产甲酸草酸杆菌oxc基因存在一定的变异；oxc基因可在真核细胞293细胞中表达。

肠道食草酸杆菌与草酸钙尿石的关系

对３０例尿石及４５例正常人的肠道食草酸杆菌分离培养并对其生物学特性及形态作初步观察。证实尿石病人粪便的肠道食草酸杆菌数（平均１０３／ｇ），显著低于正常对照组（平均１０８／ｇ），Ｐ＜０．００１）。提出肠道食草酸杆菌浓度过低可能是形成草酸钙结石的重要原因。

克隆与表达产甲酸草酸杆菌代谢基因Frc及临床意义

目的研究产甲酸草酸杆菌草酸代谢基因Frc转化大肠杆菌BL21后稳定表达代谢草酸相关性酶--甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)对草酸的降解效能。方法成功培养产甲酸草酸杆菌后,采用PCR方法从产甲酸草酸基因组中获得Frc基因,克隆到pMDTM19-T载体上进行测序,得到正确的基因片段。经双酶切将目的基因片段插入到原核表达载体PGEX-4T-2上,测序正确后,转化大肠杆菌BL-21,IPTG诱导表达GST-FCoAT融合蛋白,表达产物行western-blot鉴定分析。结果重组克隆载体pMDTM19-Frc经测序鉴定序列正确。成功构建融合原核表达质粒PGEX-4T-2-Frc,大肠杆菌BL21成为载体,并稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT的同时获得代谢草酸潜能。结论克隆产甲酸草酸杆菌Frc基因,成功构建PGEX-4T-2-Frc载体,并转化大肠杆菌BL21,能稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT,具有代谢草酸潜能,为肠道细菌获得代谢草酸潜能,减少胃肠道内草酸的吸收,降低尿液中草酸含量和临床防治草酸结石的研究奠定理论基础。

草酸钙结石患儿的肠道产甲酸草酸杆菌与尿草酸的关系

目的 探讨特发性草酸钙结石患儿的肠内产甲酸草酸杆菌的定殖以及与24h尿草酸的关系.方法 应用聚合酶链反应（PCR）检测20例特发性草酸钙结石患儿（2～18岁）的大便样本中的产甲酸草酸杆菌的存在.根据年龄、性别匹配20名健康儿童作为对照组.同时,留取这些儿童的24h尿并使用离子色谱法测定尿草酸含量.结果 在结石组中,6例检出产甲酸草酸杆菌（30％）.与正常对照组比较,其定殖率差异无统计学意义（40％,P＞0.05）.在结石组中,检测到肠道定殖产甲酸草酸杆菌的患儿的24 h尿草酸排泄要明显低于未检测到定殖的患儿[（0.79±0.29） mmol/（kg·24 h）比（1.16 ±0.32） mmol/（kg·24 h）,P＜0.05].结论 特发性草酸钙结石患儿的高草酸尿排泄可能是因为肠道内产甲酸草酸杆菌缺乏导致.

产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因和草酰辅酶A脱羧酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建尉人肠道米源产甲酸草酸杆菌（OxCF）甲酰辅酶A转移酶（FCoAT）基因（FRC）和草酰辅酶A脱羧酶（OCoAD）基因（OXC）的重组慢病毒pLenti6．3-FRC—IRES—EGFP和pLenti6．3-OXC—IRES—DsRED，为高草酸尿症的基因治疗奠定基础。方法采用Taq高保真DNA聚合酶从OxCF基因组中扩增FRC基因和OXC基因片段，用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收，用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-TSimple载体连接获得FRC和OXC的克隆载体，并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆并测序，筛选携带完整目的基因质粒pMD18Tsimple—FRC和pMD18Tsimple—OXC，用BamHI酶切获得目的基因，连接FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6．3／v5DEST—IRES—EGFP，连接OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6．3／v5DEST—IRES—DsRED，转化DH5a后挑取阳性克隆并测序。构建的慢病毒过表达载体pLenti6．3-FRC—IRES—EGFP和pLenti6．3-OXC—IRES—DsRED转染ttEK293T细胞，包装并测滴度。结果聚合酶链反应（PCR）从OxCF基因组中扩增分获得1．3kh和1．7kh的DNA片段，与Genbank中FRC（U82167）间碱基序列匹配率为95．88％，存在53个碱基的变异；与Genbank中OXC（M77128）间碱基序列匹配率为93．61％，存在109个碱基的变异；测序证实pLenti6．3-FRC—IRES—EGFP和pLenti6．3-OXC—IRES—DsRED分别含有大小正确的正向FRCcDNA和OXCcDNA，转染ttEK293T细胞实验24h后，在荧光显微镜下相应可见大量绿色荧光和红色荧光，两种慢病毒滴度分别为1．15×10^8TU／ml和9．75×10^7TU／ml。结论成功构建表达OxCF中草酸分解关键基闵FRC和OXC的重组慢病毒载体，并通过转染293细胞制备了高滴度慢病毒。

产甲酸草酸杆菌FRC基因慢病毒表达载体构建及鉴定

产甲酸草酸杆菌（Oxalobacter{ormigenes，m．F）是一种寄居于脊椎动物胃肠道、依赖分解肠道草酸生存的革兰阴性菌。我们采用基因克隆重组技术从前期分离培养的中国人肠道Ox．F[3-中克隆了草酸分解关键酶——甲酰辅酶A转移酶（FCoAT）基因FRC，并成功构建重组慢病毒表达载体pLenti6．3FRC—IRES-EGFP，为高草酸尿症基因治疗提供基础。

基因工程构建表达融合蛋白GST-FCoAT的益生大肠杆菌EcN-Frc

目的:将产甲酸草酸杆菌代谢草酸基因Frc克隆至表达载体PGEX-4T-2,转化大肠杆菌EcN,稳定表达甲酰辅酶A转移酶。方法:采用PCR方法从产甲酸草酸杆菌基因组中获得Frc基因,插入到载体PGEX-4T-2,转化EcN,IPTG诱导表达GST-FCoAT融合蛋白,产物行western-blot鉴定分析。结果:EcN-Frc可稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT。结论:改造后的EcN能诱导表达甲酰辅酶A转移酶,将为下一步体内外代谢草酸实验和临床治疗高草酸尿和防治草酸结石的益生菌制剂的研究奠定基础。

肠道菌群对草酸钙结石的影响

肾结石是泌尿系统常见疾病之一,其中约80%的肾结石主要由草酸钙组成。肠道菌群作为一个庞大的细菌网络,其相互作用是复杂的。肠道微生物组可能在肾结石的发病机制和预防中起重要作用。草酸钙结石患者肠道菌群有其独特分布。产甲酸草酸杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠埃希菌和雷氏普罗威登斯菌等菌群与草酸钙结石有密切的关系,这为泌尿系结石的防治提供了新思路。

构建可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系

背景: 高草酸尿是结石形成的危险因素之一,利用基因工程和干细胞技术构建具有高代谢草酸能力的细胞系,将成为防治草酸钙结石的有效手段。目的: 将产甲酸草酸杆菌的草酸分解基因Frc和Oxc共转染至正常成人骨髓间充质干细胞,构建可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系,使之获得分解草酸的功能。方法: PCR法扩增出Frc和Oxc基因的编码序列,构建真核表达载体pLEGFP-N1-myc-Frc和pBaBE-puro-flag-Oxc,将其共转染至正常成人骨髓间充质干细胞,以转染空载体及未进行转染的正常成人骨髓间充质干细胞作为对照。采用Westernblot检测目的基因表达情况;离子色谱法测定转基因后细胞培养液中草酸浓度。结果与结论: 酶切鉴定和测序结果显示实验成功扩增了Frc和Oxc基因,并构建了pLEGFP-N1-myc-Frc和pBaBE-puro-flag-Oxc载体。将其转染至正常成人骨髓间充质干细胞后,Westernblot检测结果显示其可稳定表达目的蛋白myc-甲酰辅酶A转移酶和flag-草酰辅酶A脱羧酶;离子色谱仪检测结果显示,随着培养时间的延长,转染目的基因的人骨髓间充质干细胞培养液中草酸浓度逐渐下降。而转染空载体及未进行转染的正常成人骨髓间充质干细胞无目的蛋白表达,也无分解草酸能力。说明实验成功构建了可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系,该细胞系可稳定表达草酸分解蛋白Frc和Oxc,并具有草酸分解能力。