猪链球菌荚膜多糖合成相关基因簇保守区的克隆与分析

【目的】为了解猪链球菌各血清型荚膜多糖合成相关基因保守区的功能与基因进化关系,【方法】在分析已知的猪链球菌1、2、7、9型荚膜多糖合成相关基因簇序列,及其各orf与猪链球菌33个血清型基因组DNA杂交结果的基础上,提出猪链球菌荚膜多糖合成相关基因簇具有与肺炎链球菌相似的盒样结构的假设。并采用PCR、测序和Southern印迹杂交等方法验证这些假设。【结果】结果显示,猪链球菌的荚膜多糖合成相关基因簇确存在与肺炎链球菌相似的盒样结构,5'端的前4个调节相关基因同源性极高,基因簇两端都有保守的侧翼基因,且在3'端的侧翼序列中找到了适于扩增荚膜多糖合成相关基因簇中血清型特异性区域的下游引物所在基因(aroA)。分析发现,各血清型的orfY、orfX、cpsA、cpsB、cpsC、cpsD和aroA的亲缘关系较近。

11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因的分子生物学研究

目的利用分子生物学方法,研究7株11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因(cps loci)。方法根据11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因设计合成5对特异性引物,以7株肺炎链球菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定及基因序列比对,确定其血清型。多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术分析7株11群肺炎链球菌序列型(ST)。采用相邻合并分析(neighbour-joining analysis),根据MLST的7个管家基因和cps基因分别绘制系统发育树。结果根据wcw C、gct和wcj E等3个基因产物确定5株原11A型肺炎链球菌为11A型,无11E型;根据wcwR和gct等2个基因产物确定2株原11B型肺炎链球菌为11B型。获得7株不包括4个合成调控基因(wzg、wzh、wzd和wze)的11群肺炎链球菌cps loci,长度为11～12 kb,11A型具有12个开放式阅读框(ORF),11B型具有11个ORF。5株11A型肺炎链球菌部分cps基因序列差异较大; 2株11B型肺炎链球菌部分cps基因序列相似性高于99%。根据MLST分析发现3种新的ST型。根据MLST的7个管家基因绘制的系统发育树和cps基因绘制的系统发育树差异很大。结论从分子水平上确定了11A和11B血清型。获得了5株11A型和2株11B型肺炎链球菌ST型和部分荚膜多糖合成相关基因(cps loci),完善了11群肺炎链球菌的菌种档案。

6群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因的分子生物学研究

目的利用分子生物学方法,对25株6群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因(cps loci)进行研究。方法采用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术,对25株6群肺炎链球菌进行分型;依据Gen Bank中收录的6群肺炎链球菌cps loci设计合成引物,以25株肺炎链球菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行基因测定及分析;采用相邻合并分析(neighbour-joining analysis),根据MLST的7个管家基因和wciP、wzy、wzx这三个cps loci的代表基因分别绘制出系统发育树。结果根据MLST技术分析发现7株新的ST型菌株。25株6群肺炎链球菌cps loci的G+C含量为35.4%~35.5%,均属于I类;所有6C型wzy基因均有6个碱基的缺失。根据MLST的7个管家基因绘制的系统发育树,并根据cps loci的3个代表基因wciP、wzy和wzx绘制的系统发育树,差异很大。3个代表基因绘制的系统发育树,6C型为进化距离比较远的分枝,6A型和6B型的分枝进化距离相对较近;6D型与6B型在同一分枝内。结论获得了25株6群肺炎链球菌ST型和全长cps loci,完善了6群肺炎链球菌的菌种档案。

链丝菌素类抗生素生物合成途径及相关基因组特性的研究进展

介绍了链丝菌素类抗生素生物合成途径和其基因簇的研究进展 ,主要内容包括 :生物合成途径、生物合成中催化多聚 β 赖氨酸链肽键形成的关键酶、生物合成基因簇的结构特点。

基于转化相关重组克隆曲酸合成基因簇及其在黑曲霉中的异源整合表达

【背景】黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的丝状真菌底盘细胞,然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇,因相应DNA分子量大而难以克隆,大部分基因与产物分子之间的映射关系尚未被解析。【目的】开发一种适配黑曲霉的大片段DNA分子直接克隆的方法。以直接克隆米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的曲酸合成基因簇(约30 kb)在黑曲霉底盘细胞中表达,实现曲酸的异源发酵。【方法】基于转化相关重组(transformation-associated recombination,TAR)克隆,构建适配黑曲霉转化的TAR捕获骨架载体pSEA-TAR;将曲酸合成基因簇上下游各1 kb同源DNA序列先后引入pSEA-TAR,中间以唯一的XhoⅠ相隔,得到曲酸合成基因簇捕获载体pSEA-KLR;随后,将NotⅠ/SbfⅠ消化后含有完整曲酸合成基因簇及上下游同源序列的米曲霉基因组与经XhoⅠ线性化的pSEA-KLR共同转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)VL6-48,通过营养缺陷筛选获得成功捕获曲酸合成基因簇的重组子,提取质粒,电转化大肠杆菌(Escherichia coli)扩增重组质粒;借助农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导黑曲霉转化,对获得的含有曲酸合成基因簇的黑曲霉转化子进行曲酸发酵,检测曲酸合成水平。【结果】获得了含有ARSH4/CEN6、TRP1、hph和LB/RB-T-DNA repeat的基于TAR克隆、适配黑曲霉表达的大片段DNA捕获载体pSEA-TAR。借助酿酒酵母高效的同源重组系统,通过同源重组获得含有曲酸合成基因簇的重组质粒pSEA-TAR-KA,捕获成功率为5.9%。对获得的含有曲酸合成基因簇的10株黑曲霉重组菌株KA1–KA10进行发酵分析发现均成功合成了曲酸,其中黑曲霉KA-2发酵7 d后曲酸水平最高,达到5.86 g/L。【结论】构建了适配黑曲霉的TAR克隆体系,用于大片段DNA高效捕获、重构和表达大型生物合成基因簇。以来源于米曲霉的曲酸合成基因簇捕获及在黑曲霉中成功实现曲酸合成验证了其有效性,进一步丰富了黑曲霉作为底盘细胞在重要化合物绿色生物制造中的作用。

CRISPR/Cas9基因编辑系统在获取放线菌天然产物中的应用

作为临床药物的重要来源,放线菌天然产物及其衍生物已被大规模开发并应用于临床.为了实现放线菌来源活性天然产物的高效合成、新型天然产物的结构衍生以及未知天然产物的定向挖掘,往往需要聚焦于生物合成基因簇,运用生物学技术开展理性的遗传改造.规律性成簇间隔的短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR/Cas)是部分细菌和古细菌在长期自然进化过程中发展而来的一种对抗外源遗传物质入侵的适应性免疫防御系统.以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑系统已被广泛应用于脱氧核糖核酸(DNA)片段的靶向特异性切割,为生物技术领域的发展提供了无限可能.综述了CRISPR/Cas9系统在放线菌遗传改造中的应用情况,包括在基因簇抓取、编辑与重构、原位同源重组以及代谢调控方面的研究进展,涉及全新的CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法以及代表性的成功案例,为高效利用CRISPR/Cas9系统获取放线菌天然产物提供了借鉴.