牛源金黄色葡萄球菌与无乳链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的研制与免疫原性研究

为了评价牛源金黄色葡萄球菌J581株和无乳链球菌A20株荚膜多糖蛋白结合疫苗的免疫原性,对制备的3批荚膜多糖进行了多糖、蛋白质及核酸含量检测,同时分别用纯化的J581和A20株荚膜多糖与破伤风类毒素偶联制备了质量浓度分别为5、10、15μg/m L的6种荚膜多糖蛋白结合疫苗及质量浓度各为10μg/m L的J581和A20株荚膜多糖蛋白结合混合疫苗,用这几种疫苗对小鼠进行免疫,采用间接ELISA方法及Ig G试剂盒对免疫前后不同时间段的小鼠血清进行抗J581和A20株荚膜多糖的特异性抗体水平及Ig G抗体效价检测。结果表明,制备的3批纯化荚膜多糖中,J581多糖平均质量浓度为49.78 mg/L,A20多糖平均质量浓度为55.76 g/L,2种多糖中蛋白和核酸含量均低于1%,符合疫苗生产要求;小鼠免疫试验结果表明,6种不同多糖含量的荚膜多糖蛋白结合疫苗和荚膜多糖混合疫苗均能刺激机体产生一定水平的特异性抗体效价及Ig G抗体,且在第28天抗体水平达到最高,其中荚膜多糖蛋白混合疫苗组中J581和A20抗体效价及特异性Ig G水平均显著高于6种单疫苗组(P<0.05)。本研究为研制金黄色葡萄球菌和无乳链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗奠定了基础。

合成生物学在多糖结合疫苗研发中的应用

由于合成生物学的快速发展,目前已经实现了人工设计DNA和蛋白质的合成,对具有重要生物学功能、结构也更为复杂的糖类物质进行精准设计合成,也将是合成生物学未来发展的重要方向。近年来,一种基于细菌寡糖转移酶体系的蛋白多糖偶联技术发展迅速,已被广泛应用于病原细菌多糖结合疫苗的生物合成制备。本文综述了该技术体系中的寡糖转移酶元件、载体蛋白元件、异源多糖抗原合成线路以及工程菌株改造等核心关键模块的最新研究进展。使用生物活体系统,发酵生产多糖结合疫苗,具有产物均一性好、步骤简便、绿色环保等优势,是一种亟待发展的新兴技术,同时也存在一些技术细节需要完善。未来,寡糖转移酶的定向进化、纳米颗粒型蛋白载体的应用、多糖合成基因的组合重排、工程菌株的代谢途径优化,将有望进一步促进多糖结合疫苗的生物合成研究。

5型肺炎链球菌荚膜多糖与CRM197蛋白结合疫苗的制备及免疫原性的研究

目的:研制5型肺炎链球菌荚膜多糖(PN5PS)与白喉无毒突变体(CRM197)结合疫苗。方法:采用还原胺化法制备结合物,即以肺炎5型多糖的邻位羟基作为活化位点,用高碘酸钠进行氧化,形成的醛基与CRM197蛋白上的氨基生成席夫碱反应,在氰基硼氢化钠的作用下形成共价结合物,并将制备的结合物与两种不同铝佐剂吸附,用间接ELISA法检测大鼠血清中针对肺炎5型多糖的抗体效价,比较结合疫苗与不同佐剂吸附前后的免疫原性。结果:当多糖活化度为7. 3时,总糖及蛋白的回收率较高,游离糖含量较低,糖蛋白结合比在1. 2~2.7时结合疫苗具有较强的免疫原性,结合比为1. 9时结合疫苗的免疫原性最强;结合物吸附磷酸铝佐剂后所产生的抗体水平略高于氢氧化铝。结论:通过还原胺化法制备的PN5PSCRM197结合疫苗具有较好的免疫原性。

5型肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的不同糖蛋白比与免疫原性的关系

实验中比较了以不同糖蛋白比结合的5型肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的免疫原性。以氨还原法制备的不同糖蛋白比的5型多糖结合疫苗分别经腹腔注射NIH小鼠,共免疫3次,间隔2周。末次免疫2周后采血分离血清,以间接ELISA测定血清抗体,t检验统计分析数据。结果显示,生理盐水组(R组)无免疫原性;5型荚膜多糖组(H组)免疫原性低,无免疫加强效应;结合疫苗M组、N组第1、2针有免疫加强效应,第2、3针无免疫加强效应,而F组和Q组的两针次间均有明显的免疫加强效应。说明5型肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的糖与蛋白比较高时能获得较好的免疫原性。

3型肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗的研制

目的:研制3型肺炎球菌荚膜多糖-CRM197结合疫苗。方法:将3型肺炎球菌的荚膜多糖与蛋白CRM197通过化学方法偶联结合,制备成多糖蛋白结合疫苗并使用该疫苗免疫幼小鼠。结果:经过实验条件的考察,发现在85℃,0.2mol/L乙酸水解处理多糖1 h,活化度为10.0,投料比为20∶10时制得的疫苗,在小鼠体内产生了高滴度的抗体。结论:该实验条件下制备的结合疫苗保留了完好的抗原性,以本工艺条件制备3型肺炎球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗是可行的。

A群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性研究

采用溴化氰(CNBr)活化多糖,以无水己二酸二肼(ADH)作为连接剂,1乙基13(3二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)为偶联剂制备A群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖(GAMP)与破伤风类毒素(TT)的结合物,经皮下免疫NIH小鼠,用ELISA检测小鼠血清中抗GAMP及抗载体蛋白的IgG抗体水平。用补体介导的体外杀菌试验检测血清中GAMP抗体的杀菌活性。结果显示,实验中制备的多糖衍生物和多糖蛋白质结合物都具有GAMP抗原特异活性。结合物免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的GAMP血清IgG抗体,并能形成免疫记忆,产生再次应答。结合物免疫小鼠所诱生的血清GAMP抗体较之多糖组具有更强的体外杀菌活性。表明此方法制备的结合物可获得优于多糖的、稳定的特异免疫原性。

14型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的研制

将14型肺炎球菌的荚膜多糖(PS)与破伤风类毒素(TT)通过化学方法结合,制备成多糖-蛋白结合疫苗(PS14-TT)。用该结合疫苗免疫小鼠,在小鼠体内产生了高滴度的PS-IgG抗体和TT-IgG抗体,且再次注射后有加强应答效应,表明制备的结合疫苗保留了完好的抗原性,具有胸腺依赖性抗原的特性。

通过CDAP活化多糖制备b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-D蛋白疫苗初探

目的用CDAP活化b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖,制备b型流感嗜血杆菌荚膜多糖及D蛋白疫苗。方法采用CDAP法在不同p H值条件下活化Hib荚膜多糖,再通过乙二酰肼(ADH)与D蛋白共价结合,制备Hib荚膜多糖与其D蛋白结合物原液,并对三批结合物原液的各项指标进行检测。获得的结合物原液免疫BALB/c小鼠,应用ELISA法检测血清中的Ig G抗体水平,评价其免疫原性。结果三批结合物原液以上检测指标均符合药典要求,衍生物中ADH含量对结合物的免疫原性有重要影响。结论用CDAP活化工艺制备的Hib荚膜多糖-D蛋白结合物适宜制备结合疫苗,为以D蛋白为载体的Hib结合疫苗的制备及五价联苗的研制奠定实验基础。

C群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-TT结合疫苗的制备及其在小鼠体内免疫原性的研究

将C群脑膜炎球菌荚膜多糖以ADH作为间隔剂与TT结合形成GCMP-TT结合疫苗,然后用此结合疫苗免疫NIH小鼠,结果显示使用GCMP免疫小鼠后仅能产生较低水平抗GCMP的IgG抗体,而用GCMP-TT免疫后小鼠血清中产生了较GCMP免疫显著增高抗GCMP的IgG抗体,并且GCMP-TT组第二次和第三次免疫后与初次免疫相比,IgG抗体水平均有显著升高(P<0.01),表明GCMP-TT结合疫苗具有免疫记忆和再次免疫加强应答效应。补体介导的血清抗体体外杀菌试验结果证明,GCMP-TT结合疫苗组免疫小鼠诱导的抗体IgG比GCMP组具有增强的体外杀菌活性。

离子色谱在多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗质量控制中的应用

离子色谱具有方便、快速、灵敏度高、选择性好、重现性好、准确度高、可同时分析多种离子化合物等优点,其中的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)可直接分析糖类物质,可应用于多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗中多糖的分析。近年来,离子色谱应用在多糖及多糖蛋白结合疫苗的质量控制中,如测定疫苗中的多糖、游离糖、杂质多糖、对人有免疫原性的功能基团等的研究有许多报道,对有关内容进行了综述。

A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗衍化工艺的研究

目的:筛选和优化A群脑膜炎多糖的衍化工艺。方法:将A群奈瑟氏脑膜炎球菌多糖经溴化氰活化后通过己二酰肼衍生后制备出适宜的多糖衍生物。对衍化条件进行摸索和优化后通过衍化率及衍生物的可溶性来考察衍化效果,同时通过生化指标来考察该衍生工艺制备的结合疫苗的质量和收率。结果:在pH 11.0±0.2、活化30 min以及溴化氰与多糖比值(w/w)=0.5时,衍生物制备的结合疫苗各项生化指标在所筛选的条件中最优。结论:经过筛选优化的衍生工艺提高了多糖的衍化率,适宜结合疫苗的研制,保证了其结合疫苗的免疫原性。

不同蛋白载体的痢疾多糖结合疫苗小鼠免疫原性对比试验

试验中以小鼠为动物模型 ,对不同蛋白载体的痢疾多糖结合疫苗进行免疫效果观察。 3种福氏 2a痢疾结合疫苗和 3种宋内氏痢疾结合疫苗分别皮下免疫NIH小鼠 ,同时设置O SP(O 特异性多糖 )对照组 ,免疫 3针 ,在不同免疫针次间采血 ,用ELlSA测定抗体滴度。单独使用福氏 2aO SP和宋内氏O SP免疫后 ,小鼠血清中几乎没有抗LPSIgG抗体产生 ,而用结合疫苗免疫后 ,小鼠血清中产生了抗LPSIgG抗体 ,且第二次、第三次免疫后 ,小鼠血清中抗LPSIgG抗体水平有显著升高 ,表明结合疫苗具有加强免疫应答效应。三种不同的痢疾结合疫苗相比较 ,F 2a O SP rEPA结合疫苗较F 2a O SP TT结合疫苗和F 2a 0 SP DT结合疫苗的小鼠抗LPSIgG抗体水平高 ,S O SP rEPA结合疫苗较S O SP TT结合疫苗和S O SP CRM 9,结合疫苗的小鼠抗LPSIgG抗体水平高。以rEPA作为载体的痢疾结合疫苗比DT 。

基于毕赤酵母制备的SARS-CoV2RBD-重组蛋白疫苗的免疫方案优化及不同佐剂对中和抗体滴度的影响

目的对基于毕赤酵母制备的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD重组蛋白疫苗的免疫方案进行优化并考察不同佐剂对中和抗体(NAb)滴度的影响,为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供参考。方法将RBD基因片段亚克隆至pPICZαA质粒,质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达,将获得的重组蛋白疫苗联合不同的佐剂对小鼠进行免疫以评估其免疫原性。结果目标蛋白wtRBD和Delta RBD均能通过毕赤酵母系统获得满意过表达;与42 d间隔时间相比,28 d间隔时间的IgG抗体滴度增加了1.8倍(44923 vs.80507);间隔28 d的3剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度比间隔42 d高2.5倍(2191 vs.891);Delta RBD重组蛋白疫苗联合铝佐剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度达到了32255(2167~88084);在采用5μg或30μg Delta RBD免疫情况下,铝佐剂+CpG佐剂组的NAb滴度均为单独采用铝佐剂组的10倍左右;第3次免疫后,5μg抗原组与30μg抗原组中Delta RBD特异性IgG滴度差异无统计学意义(P>0.05)。结论基于毕赤酵母制备的wtRBD或Delta RBD都可以用作有效的抗原,间隔28 d的3剂疫苗给药最有效,Delta RBD重组蛋白与铝佐剂+CpG佐剂的联合免疫能够获得更高滴度的NAb以对SARS-CoV-2及其变体发挥免疫作用,可为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供一定参考。

肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的研制及其在幼小鼠体内诱导的免疫应答

目的研制肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗,并通过幼小鼠的动物实验检测其免疫原性。方法用19F 型肺炎球菌多糖以氨基还原法分别与牛血清白蛋白及鸡卵清蛋白偶联结合,以凝胶柱纯化,加入铝佐剂制备成疫苗,然后分别以3种不同多糖含量的结合疫苗腹腔接种3wk 龄幼小鼠,每隔2wk 复种一次,接种3次后采血。多糖对照组幼小鼠以19F 型肺炎球菌多糖疫苗接种,阴性对照组以0.15 M PBS 接种。用 ELISA 法检测动物血清中抗肺炎球菌多糖抗体水平。结果经层析后肺炎球菌多糖蛋白结合物的 OD 峰值较多糖及载体蛋白的各自峰值均明显前移,以多糖含量分别为0.25μg、1.0μg、4.0μg的结合疫苗接种的3组幼小鼠血清中抗肺炎球菌多糖抗体平均滴度分别为1:400、1:800、1:1600,多糖对照组为1:50(P<0.05)。结论已建立制备肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的方法,该疫苗能在幼小鼠体内引起明显的免疫应答。

猴痘病毒新型蛋白疫苗制备及其诱导抗体能力评估

目的构建有效的猴痘病毒(MPXV)和痘苗病毒(VACV)蛋白疫苗,并对其诱导抗体的活性进行初步评估。方法采用融合蛋白表达技术构建MPXV-A29-Fc和VACV-A27-Fc蛋白疫苗,酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质印迹法(Western blot,WB)体外检测蛋白结合抗体的能力,BALB/c雌性小鼠体内评估不同剂量蛋白疫苗诱导抗体的效价。结果MPXV-A29-Fc和VACV-A27-Fc蛋白均能与A29单克隆抗体结合,蛋白疫苗免疫小鼠后,不同剂量组中的小鼠血清均可交叉识别MPXV-A29和VACV-A27蛋白,三针免疫可诱导更强的交叉免疫应答,三针免疫后,不同的血清稀释度下,低剂量组的IgG抗体结合强度均与高剂量组相当,可达到高剂量组的免疫效果。结论本研究初步构建有效的MPXV和VACV新型蛋白疫苗MPXV-A29-Fc和VACV-A27-Fc,在小鼠体内可诱导特异性抗体反应和交叉抗体反应,可为猴痘病毒的疫苗设计提供新的思路和方法。

细菌性多糖-蛋白质结合疫苗的免疫学

本文对细菌性表面多糖 (CPS ,O SP)的免疫原性、影响多糖免疫原性的因素、多糖 蛋白质的免疫学机理进行了综述。

肺炎球菌结合疫苗诱导的抗荚膜多糖抗体活性研究

目的 研究肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物在小鼠体内诱导产生的功能性抗体活性。方法 用荚膜多糖及其结合物免疫BALB/c小鼠,用ELISA法测定小鼠血清IgG抗体,用KSCN解离法测定IgG抗体的亲和力,用体外调理吞噬实验测定血清的调理吞噬滴度。结果 18C-TT、19F-TT免疫小鼠后,抗体滴度显著升高,有免疫记忆反应,18C-TT第1针和第3针免后的抗体亲和指数(AI)分别为22.3％±4.8％和49.7％±1.8％,调理吞噬滴度分别达到16和32;19F-TT免后AI分别为52.6％±3.0％和61.6％±3.4％,调理吞噬滴度则分别为32和64。结论18C-TT和19F-TT免疫小鼠后,能有效地产生再次免疫应答,其IgG有良好的亲和力和补体依赖的调理吞噬功能,能有效地清除肺炎链球菌的感染。

肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗两种免疫途径对小鼠抗体应答的比较

目的比较肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗两种免疫途径对小鼠的抗体应答。方法选NIH小鼠,分别经皮下和腹腔途径免疫3次同等剂量的结合疫苗,每次间隔2周,用ELISA方法检测两种途径免疫小鼠的血清抗体滴度。结果结合疫苗经腹腔免疫后的抗体滴度优于皮下免疫。小鼠经腹腔免疫3次后,血清抗体的几何平均滴度分别是第1次免疫的6·6倍和3·5倍。结论结合疫苗经腹腔免疫较皮下免疫获得的抗体应答水平高。