荚膜A型多杀性巴氏杆菌引起牛纤维素性化脓性肺炎:病原引起疾病因果关系的确定

2006年底本研究室在牛群中发现了病因不明的牛纤维素性化脓性肺炎疫情,该疫情已蔓延至中国的多个养牛地区,本研究室从发病牛肺脏中分离得到荚膜A型多杀性巴氏杆菌。为确定该菌与牛纤维素性化脓性肺炎的病原-疾病因果关系,本研究从病原流行病学调查、病原对实验动物的致病性与免疫保护性以及病原回归本动物致病特征3个方面,对其进行验证性研究。调查结果显示,在2008年~2014年采集的88份发病牛肺脏样品中,荚膜A型多杀性巴氏杆菌的PCR阳性率高达86.36%,而且PCR阳性样品中该菌的分离率高达90.79%。将现地分离株接种小鼠进行动物实验,结果显示,该菌具有高度致死性,而且灭活菌体接种小鼠对活菌攻击呈现良好的免疫保护性。动物回归试验结果显示,健康犊牛接种该分离菌株后出现与自然感染病例相似的纤维素性化脓性肺炎,免疫组化试验显示该菌株分布于病变肺组织、并从中重新分离出接种的病原菌。上述研究结果符合病原微生物鉴定的科赫法则,因此确定荚膜A型多杀性巴氏杆菌是引起牛纤维素性化脓性肺炎的病原。荚膜A型多杀性巴氏杆菌与牛纤维素性化脓性肺炎病原-疾病因果关系的确立,为该新发疫情防控技术的研究提供了参考依据、奠定了实验基础。

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫攻毒模型的建立

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pm)是典型的条件致病菌,为建立该病原菌的免疫攻毒模型,本研究采用不同代次、不同剂量的Pm-TJ株接种实验动物小鼠和本动物牛,测定其对小鼠的最小致死剂量以及对牛的最小感染剂量;在此基础上,将制备的全菌体灭活疫苗分别免疫小鼠和牛,通过攻毒保护试验评价该疫苗对动物的免疫原性。攻毒试验结果显示,Pm-TJ株对小鼠高度致死,最小致死剂量为10 cfu,而且不同代次细菌的毒力无显著差异,表明其在体外传代过程中毒力保持稳定;能够引起Pm-TJ株接种牛典型的纤维素性化脓性肺炎,而且接种牛的发病率呈现剂量依赖性,最小感染剂量为2.5×10~8 cfu。免疫后攻毒试验结果显示,将含有1×10~7 cfu灭活菌体的疫苗接种小鼠,其能够抵抗致死剂量细菌的攻击;用含有7.5×10~9 cfu灭活菌体的疫苗接种犊牛,用两倍最小感染剂量细菌攻击,免疫牛能够获得有效保护。本研究利用实验动物小鼠和本动物牛建立了牛荚膜A型Pm的免疫攻毒模型,并表明该全菌体灭活疫苗具有良好的免疫原性,这些研究结果为Pm疫苗的研发奠定了实验基础。

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌强菌株rpoE蛋白的原核表达及其免疫保护效力研究

为研究牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(PM)强菌株rpoE蛋白的免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增牛荚膜A型PM的rpoE基因,构建pET-28a-rpoE重组表达质粒,经诱导表达后SDS-PAGE检测结果显示,表达的rpoE蛋白相对分子量约为20 ku,与理论值一致;western blot结果显示该蛋白具有很好的特异性和反应原性;纯化的rpoE蛋白经皮下免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测融合蛋白的免疫原性,结果显示rpoE蛋白可以诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体;PM攻毒后,免疫组保护率为70%。本研究获得的牛荚膜A型PM重组rpoE蛋白具有良好的免疫原性,免疫小鼠后能够提供一定的保护,可以作为研发PM亚单位疫苗的候选抗原。