产气荚膜梭菌B型C58-1株β1毒素基因的克隆表达

利用PCR技术,从B型产气荚膜梭菌中国标准株C58-1株扩增出β1毒素基因,连接pMD18-T载体筛选阳性克隆,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收927bp的β1毒素基因片段,将其定向克隆到载体pET-32a中,获得重组质粒pETβ927。将pETβ927转化至受体菌BL21(DE3)中,其表达产物经His-Trap FF预装柱纯化、SDS-PAGE检测目的蛋白大小和分布及Western blotting检测其反应原性。结果表明,完整的β1毒素基因大小为1 011bp,与GenBank发表的B型和C型产气荚膜梭菌β1毒素蛋白序列同源性达99.4%以上;SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白大小为54ku,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但以包涵体为主。Western blotting检测结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体发生免疫反应,表明β1毒素蛋白具有较好的反应原性。

B型产气荚膜梭菌对补硒母羊产新生羔羊的攻击试验

采用人工攻击 B型产气荚膜梭菌的方法 ,观察了 B型产气荚膜梭菌对青海三角城羊场补硒羊只的致病性 ,结果表明 ,B型产气荚膜梭菌不引发补硒母羊产新生羔羊的羔羊痢疾。

B型产气荚膜梭菌C58-1株ε毒素基因序列分析与可溶性表达

利用PCR技术从B型产气荚膜梭菌扩增出ε毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收984bp的ε毒素基因片段,将其定向克隆在载体PET-32a中,获得重组质粒pETε984。将pETε984转化至受体菌BL21(DE3)中。重组菌株经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PACE分析。结果表明,重组目的蛋白在大肠埃希菌成功表达,融合蛋白大小为51ku,存在于细菌培养上清中,可溶性蛋白占菌体总蛋白相对含量的67.8%。序列分析表明C58-1株ε毒素蛋白序列与目前公布的所有B型和D型产气荚膜梭菌同源性均在99.7%以上,但ε毒素蛋白序列第321位出现了S→Y突变。研究结果为ε毒素蛋白的亚单位疫苗研究奠定了基础。

B型产气荚膜梭菌三种主要毒素基因的PCR检测

为了对B型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type B)进行快速检测,依据NCBI登录的产气荚膜梭菌α、β及ε毒素基因序列设计引物,并对其进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示3个毒素基因均被成功扩增,目标片段条带清晰,长度与预期相符。

产气荚膜梭菌D型、B型提纯抗原冻干后的保存期与抗原性

原生产羊梭菌病灭活疫苗的羊肠毒血症 (产气荚膜梭菌D型 )、羔羊痢疾 (产气荚膜梭菌B型 )冻干干粉85 0 2批 (干粉分别保存 )在 2～ 8℃保存 17年后 ,与 2 0 %铝胶生理盐水配成疫苗 ,以 2、4、6、8和 12mg剂量免疫家兔 ,采血分离血清 ,与产气荚膜梭菌D型、B型相应毒素作中和试验 ,测定血清中和效价 ,检验两种干粉的抗原性。结果表明 ,干粉抗原保存 17年后 ,其羔羊痢疾、肠毒血症干粉抗原最小免疫剂量由制出时的 4mg下降为 6mg ,证明B型、D型干粉抗原 6mg免疫剂量所产生的羔羊痢疾、猝狙。

牛B型多杀性巴氏杆菌DY株的分离与鉴定

对山东东营某牛场送检的牛病料进行病原菌的分离,并对分离菌株进行形态学观察、生化试验、PCR鉴定、药敏试验和动物致病性试验。结果显示,本试验成功分离到一株荚膜血清B型巴氏杆菌,命名为DY株,为巴氏杆菌的分子生物学研究、诊断试剂研制及自家灭活菌苗的制备奠定了基础。

规模化羊场B型产气荚膜梭菌分离鉴定及生物学特性检测

2016年,山东某规模化羊场新生羔羊暴发腹泻,并伴急性毒血现象,出现部分死亡个例。对该羊场的病死羔羊进行剖检,分离4株特征病原菌（分别命名为Cp1、Cp2、Cp3、Cp4）,对病菌的形态特点、生化特性以及毒素基因序列进行PCR检测,最终确定病原菌为产气荚膜梭菌。PCR检测结果显示该菌的毒素基因有α毒素、β毒素和ε毒素;毒素毒力试验表明,产气荚膜梭菌毒素对小鼠有强致病性,并证明产气荚膜梭菌通过释放毒素致病而本身并不具有致病性;药敏试验发现,分离菌对青霉素、四环素、庆大霉素、复方新诺明和强力霉素的耐药率极高,可达85%以上,而对头孢噻肟、氯霉素、氟苯尼考、链霉素和恩诺沙星等有较强的敏感性;结合传统免疫措施配合抗生素药物的治疗,可一定程度控制该病的流行。本试验结果为羊B型产气荚膜梭菌病的防治提供了试验依据。

牛源B型产气荚膜梭菌的分离鉴定与毒力基因检测

为探究内蒙古通辽市某牛场牛猝死的原因,本研究采集病死牛肠道内容物,分别进行革兰染色镜检、全自动微生物分析系统检测、16S rRNA基因扩增、毒力基因检测及系统进化树分析、动物致病性试验、半数致死量试验。结果显示,分离菌形态、生化特性符合产气荚膜梭菌的特性;16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的产气荚膜梭菌的同源性为99%,系统进化树分析该分离菌与B型产气荚膜梭菌的亲缘性最近;3种毒力基因在该致病菌中均被检测到;分离菌对小鼠有致死性;该菌对小鼠半数致死的浓度为2.27×107CFU/mL;药敏结果显示,分离菌株对多黏菌素、庆大霉素等药物敏感,对卡那霉素等药物中度敏感,对头孢他啶、阿莫西林等药物耐药。该致病菌经鉴定,确定为B型产气荚膜梭菌,毒力基因分别为α、β2和ε毒素。

AgrB信号分子对B型产气荚膜梭菌生物被膜形成的影响

目的探讨QS系统AgrB分子对B型产气荚膜梭菌生物被膜(biofilm, BF)形成过程中htrA、rpoA基因表达水平的影响。方法体外培养B型产气荚膜梭菌12、24、36、48、56及64 h时期的BF,提取其总RNA,通过实时Real-Time PCR检测不同时间段B型产气荚膜梭菌BF agrB基因对BF形成相关基因htrA、rpoA表达的调节作用。结果 B型产气荚膜梭菌在24、36、48、56及64 h 5个时间段中,QS系统agrB基因和BF rpoA、htrA基因相对表达量均呈现出先增高后降低的趋势,且在36 h达到峰值。在峰值前期,agrB、rpoA、htrA基因的表达量较高,48 h后表达量迅速下降,提示B型产气荚膜梭菌BF形成相关基因rpoA、htrA的表达受到QS系统agrB基因表达的影响。结论 AgrB信号分子对rpoA、htrA基因调控表达趋势在产气荚膜梭菌BF形成过程呈现关联性。

一株鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为了确定引起湖北省荆州市某养鸡场鸡群发生疑似禽霍乱死亡的原因,试验从该养鸡场采集病死鸡的肝脏病原,通过细菌分离鉴定、16S rDNA克隆测序分析、荚膜和脂多糖PCR分型、药敏试验及致病性试验对病原进行了研究。结果表明:分离菌株呈革兰氏染色阴性,瑞氏染色为两极浓染的球杆菌;分离菌经荚膜和脂多糖PCR分型鉴定为荚膜B型、脂多糖L2型,将其命名为JZ-B-1;JZ-B-1菌株与巴氏杆菌的同源性高达99%以上,在系统进化树中分别与多杀性巴氏杆菌属和多杀性巴氏杆菌败血亚种处于同一分支上,属多杀性巴氏杆菌败血亚种;菌株JZ-B-1对哌拉西林、羧苄西林和青霉素有耐药性,对头孢他啶、头孢呋辛、头孢拉定、头孢唑林、头孢哌酮、头孢曲松、氨苄西林、四环素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、氯霉素、呋喃唑酮、万古霉素、氧氟沙星、诺氧沙星、麦迪霉素高度敏感。说明从病死鸡中分离的菌株为荚膜B型多杀性巴氏杆菌属败血亚种,丰富了鸡源多杀性巴氏杆菌的生物学亚型,对湖北地区巴氏杆菌病的防控和细菌耐药性研究具有一定的指导意义。

羔羊痢疾的综合防治

羔羊痢疾是一种急性致死性疾病,给养羊业造成的损失巨大。笔者结合工作实践经验,对本病的流行特点、临床症状、病理变化以及实验室诊断方法进行了简要归纳,同时提出了中西医结合治疗方案和防控措施,以期为临床诊治羔羊痢疾提供技术参考。

羔羊痢疾的流行病学、临床特征、剖检变化及其防控

羔羊痢疾是由于感染B型产气荚膜梭菌而发生的一种急性毒血症,主要是小于1周龄的新生羔羊出现发病,其中小于4日龄的羔羊易感性最高,病羔羊主要特征是严重腹泻、小肠存在溃疡。该病急性发生,病程持续时间短,病死率较高,具有明显的季节性,一般在气候寒冷和气候多变的时节发生,往往呈地方性流行。如果发病后没有及时进行诊断和采取有效的防治措施,会导致大批羔羊死亡,严重损害养羊业的经济效益。

1例羔羊痢疾的诊治

某山羊养殖户羊舍简陋,对防寒保暖设施建设意识淡薄,在冷空气突袭来临之前未做好分娩母羊舍的保暖,诱导羔羊痢疾的发生,造成部分羔羊因病死亡,影响了羊农养殖经济效益。为有效控制羔羊痢疾的蔓延,制定针对性治疗方案与防控措施,取得显著治疗效果。

羔羊痢疾病原体的分离与PCR鉴定

羔羊痢疾是由B型产气荚膜梭菌引起的新生羔羊的一种急性毒血症,临床以严重腹泻、脱水,剖检以小肠形成溃疡灶为主要症状。本试验从疑似病料中分离到病原体,通过病原体的实验室诊断和PCR鉴定,确定为B型产气荚膜梭菌。本试验的研究为羔羊痢疾病快速诊断、流行病学研究提供了科学依据,为建立多重PCR诊断方法奠定了基础。