重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的促凋亡作用

为了研究基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂诱导HL-60细胞凋亡的作用并探讨其抗癌作用机理,用不同浓度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂体外作用于HL-60细胞,采用MTT比色法检测其对HL-60细胞的抑制率,应用光学显微镜观察细胞核的形态学变化,用DNA凝胶电泳法检测HL-60细胞的凋亡,用流式细胞术检测该抑制剂作用于HL-60细胞后引起的凋亡现象。结果表明:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞(PBMNC)无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100μg/ml重组荞麦胰蛋白酶抑制剂作用后,凋亡率达到52%;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解。结论:重组荞麦胰蛋白酶抑制剂在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导细胞凋亡,这为重组荞麦胰蛋白酶抑制剂应用于急性髓细胞性白血病的治疗提供依据,也为重组基因工程植物蛋白药物的临床应用提供新思路。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对人肝癌细胞的凋亡及半胱氨酸天冬酶活性的影响

先前的研究表明,基因重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用.为了揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机理,从基因水平上探讨与凋亡有关的分子事件,本研究用不同浓度的rBTI体外作用于人肝癌细胞HepG2后,采用MTT比色法检测抑制剂对HepG2细胞的抑制率,用DNA凝胶电泳和细胞核的形态学观察检测HepG2细胞的凋亡.结果表明,rBTI在体外能够明显抑制HepG2细胞的增长,并诱导细胞凋亡.另外,细胞凋亡与Bcl-2/Bax mRNA水平有关.通过RT-PCR检测发现,细胞经过rBTI处理后,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平下调,促凋亡基因Bax mRNA有所上调,而对照GAPDH无变化.对HepG2细胞中Fas/Fas配体及半胱氨酸天冬酶(caspase)的研究证明,细胞经过rBTI处理后,对死亡受体Fas mRNA没有影响;rBTI可明显激活caspase-3和caspase-9酶活性,对caspase-8活性几乎无影响.上述结果表明,rBTI对HepG2细胞具有明显的诱导凋亡作用,其诱导细胞凋亡的机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关,未涉及Fas/Fas配体途径.

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂理化性质的研究

荞麦胰蛋白酶抑制剂(BuckwheatTrypsinInhibitor,BTI)是存在于荞麦种子中的一种抗营养因子。本文经过原核表达及两步层析纯化得到高纯度的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI。通过分析表明,重组荞麦胰蛋白酶抑制剂与天然荞麦胰蛋白酶抑制剂的性质类似。rBTI的相对分子质量约为11kDa,等电点约为6.2。rBTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制摩尔比(以BApNA为底物)为1:1.5。rBTI的最适pH值为8.0,在pH3.0～8.0之间有较好的热稳定性,100℃加热120min仍保持70%的胰蛋白酶抑制活性。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂延长C.elegans寿命的作用机制

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,r BTI）是一种来源于荞麦PotatoⅠ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,r BTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,r BTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对r BTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的r BTI突变体,分别命名为r BTI-R45A,r BTI-R45F,r BTI-W53R和r BTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型r BTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0-10μmol/L范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10μmol/L野生型r BTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体r BTI-R45 A,r BTI-R45 F和r BTI-W53 R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型r BTI可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种r BTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,r BTI可增强长寿因子DAF-16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发r BTI的功能提供了实验支持和理论基础。

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂通过下调己糖激酶Ⅱ抑制HepG2细胞生长

糖酵解过度活跃是肿瘤细胞能量代谢的显著特征。抑制过度糖酵解已经成为一种新的癌症疗法。重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinant buckwheat trypsin inhibitor,r BTI)可以通过上调磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)进而抑制Hep G2细胞增殖。有关r BTI对肿瘤细胞能量代谢的影响仍未见报道。本研究中的MTT和ATP检测分析表明,r BTI以剂量依赖性方式抑制细胞活力及胞内ATP含量。qRT-PCR和Western印迹分析表明,r BTI处理Hep G2细胞后,己糖激酶Ⅱ转录显著下调,但是糖酵解过程中的其他酶及葡萄糖转运蛋白基因在转录水平未发生显著变化,同时己糖激酶Ⅱ蛋白水平的表达也显著下调。酶活性分析也表明,r BTI能显著降低己糖激酶的活性。进一步分析表明,r BTI使细胞内PTEN转录及表达水平明显上调,己糖激酶Ⅱ转录和p-AKT,p-m TOR、己糖激酶Ⅱ的表达下调。当PTEN抑制剂phen存在时,可阻断r BTI诱导的己糖激酶Ⅱ表达下降,表明r BTI能通过上调PTEN进而影响己糖激酶Ⅱ的表达。免疫荧光及Western印迹分析显示,r BTI作用后减弱了己糖激酶Ⅱ在线粒体的定位,导致己糖激酶Ⅱ与线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白(voltage-dependent anion channel,VDAC)分离,促使己糖激酶Ⅱ从线粒体转位到细胞质,降低糖酵解的效率。上述结果证明,r BTI对肿瘤细胞能量代谢的调控作用主要通过抑制PI3K/AKT信号通路,下调己糖激酶Ⅱ的表达并影响空间定位,进而抑制肿瘤细胞糖酵解过程,导致癌细胞生长受到抑制。

响应面法优化荞麦胰蛋白酶抑制剂固定化条件

目的:以大肠杆菌表达的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂为原材料,研究其固定化方法及条件。方法:以0.2%聚乙烯醇-3%海藻酸钠溶液为载体,CaCl2为固定剂,用物理包埋法对荞麦胰蛋白酶抑制剂进行固定化;在CaCl2浓度、载体与抑制剂体积比以及固定化时间3个单因素基础上,利用响应面法对荞麦胰蛋白酶抑制剂固定化的影响因素进行优化。结果:建立了响应面法优化固定荞麦胰蛋白酶抑制剂的模型,经优化后得到如下最佳固定化条件:CaCl2浓度为5.5%,载体与抑制剂体积比为1.6∶1,固定化时间为31min。在此条件下实际测得固定化抑制剂抑制率为72.4%,而模型预测此条件下的抑制率为74.3%,实测值与理论值相差很小。结论:所建模型拟合程度较高,用该模型优化荞麦胰蛋白酶抑制剂固定化的工艺条件参数准确可信,可为进一步开发胰蛋白酶的应用提供重要参考。

rBTI通过上调PTEN的表达抑制Hep G2细胞增殖

磷酸酶及张力蛋白的同源基因(PTEN)是一种抑癌基因,可以调控细胞的增殖,与癌症的发生和发展息息相关。本研究采用MTT法和流式细胞术分别检测了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(r BTI)对人肝癌细胞株Hep G2细胞的增殖以及周期的影响。免疫荧光及Western印迹法检测了PTEN和p-PTEN的亚细胞定位及蛋白表达的变化。采用q RT-PCR及Western印迹法检测了周期相关蛋白的表达。旨在探究PTEN和p-PTEN在r BTI抑制Hep G2细胞增殖和周期阻滞中的作用。结果表明,r BTI能显著抑制Hep G2细胞增殖,将细胞周期阻滞在G0/G1期,并呈时间和剂量依赖性;r BTI作用于Hep G2后,可显著上调PTEN和p-PTEN的表达。同时发现,p-PTEN主要分布于细胞核中,能与核仁发生共定位;周期相关蛋白检测表明,细胞内p53、p21转录水平和蛋白水平均增加。综上所述,r BTI通过上调PTEN的表达,使得细胞周期阻滞于G0/G1期,进而抑制Hep G2细胞的增殖。

截短型rBTI的表达、纯化及其对EC9706细胞生长的抑制作用

依据先前获得的重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)氨基酸序列及三维分子构像,分别构建了rBTI C末端缺失VVM、TPVVM或VDTPVVM的截短型pExsecI-BTI-t1,pExsecI-BTI-t2和pExsecI-BTI-t3重组质粒.转入大肠杆菌BL21中进行表达,并通过Resource Q阴离子交换层析分离.实验结果显示,3个工程菌均以可溶方式表达,目的蛋白在SDS-PAGE图谱中显示单一条带,其纯度达98%以上.理化性质分析表明,截短型rBTI与野生型rBTI具有相似的胰蛋白酶抑制活性,并具有很好的热稳定性及酸碱稳定性.将野生型和截短型rBTI分别作用于人食管癌EC9706细胞.MTT检测发现,C末端截短不同数目的氨基酸后,与野生型rBTI相比,在相同浓度下截短型rBTI仍具有一定的抑制肿瘤细胞生长作用,其抑制作用范围是截短前的50%左右.这些结果提示,rBTI的C末端氨基酸残基缺失未引起活性区域或功能部位的较大改变,从而保留了其对胰蛋白酶的抑制作用和部分生物学功能.

一种胰蛋白酶亲和材料的制备及应用

基于抑制剂与酶的特异亲和作用,将具有良好稳定性的荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)固定化,制备成一种胰蛋白酶的亲和吸附剂,实现胰蛋白酶的高效纯化。通过原核表达、Ni2+-NTA亲和层析和Superdex G-25凝胶过滤技术得到电泳纯的BTI,以溴化氰活化琼脂糖凝胶(CNBr-Sepharose CL-4B)作为亲和层析载体,制备亲和吸附剂BTI-Sepharose,检测其对胰蛋白酶的特异性吸附作用,并进一步研究BTI-Sepharose对胰蛋白酶吸附及解吸附的条件。制备的BTI-Sepharose对胰蛋白酶具有特异吸附性,可用于胰蛋白酶的亲和纯化。缓冲液p H对BTI-Sepharose与胰蛋白酶的吸附及解吸附均有重要影响,二者吸附作用的最适pH为7.2,在pH为3.5时两者能够完全分离,且不影响胰蛋白酶的生物活性。试验制备的BTI-Sepharose可实现一步层析制备高纯度胰蛋白酶,为胰蛋白酶的高效纯化及新型胰蛋白酶的研究开发提供理论依据。

BTI基因转染诱导EC9706细胞凋亡及G_1阻滞

为了研究荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsin inhibitor,BTI)对肿瘤细胞凋亡与细胞周期的影响,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与BTI融合蛋白真核表达质粒.将BTI基因成功克隆至pEGFP-N1中转染食管癌EC9706细胞后,激光共聚焦显微镜镜检显示,BTI-EGFP获得良好表达.表达的融合蛋白大部分分布于细胞核,在细胞质中有少量分布.Western印迹检测可见约27kD和36 kD的特异性条带.流式细胞术分析结果显示,BTI能够诱导EC9706细胞发生凋亡,并使细胞停滞于G0/G1期.

BTI和Nisin复合涂膜液对鲈鱼鱼糜的保鲜效果

以明胶和壳聚糖为基本成分制备乳酸链球菌素(nisin)和荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsin inhibitor,BTI)的复合涂膜保鲜剂。用此复合保鲜剂对鲈鱼鱼糜进行涂膜处理,以菌落总数、挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量、硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)含量、pH值、蒸煮损失率等为检测指标,研究复合液对鲈鱼鱼糜的保鲜效果。结果表明,nisin和BTI联合使用可有效抑制鲈鱼鱼糜4℃贮藏过程中微生物的生长,并显著减缓TVB-N及TBARS的增长速率,降低鱼糜的蒸煮损失率。BTI可以提高nisin对蛋白酶的抗性,增强nisin的稳定性,有利于鱼糜的抗菌保鲜,延长鲈鱼鱼糜的冷藏货架期。

rBTI的制备及其对果蝇寿命的影响

构建含荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)表达质粒pExSecI-BTI的工程菌,在100 L发酵罐中放大发酵,发酵产物经热处理及离子交换层析纯化后,获得rBTI产品,其纯度达到95%以上。用含不同质量浓度rBTI(0、20、50μg/mL)的培养基饲养果蝇,并分别检测果蝇的最高寿命,平均寿命和半数死亡时间等。初步研究rBTI对果蝇寿命的影响。结果显示,rBTI能够显著延长果蝇的寿命。在实验剂量范围内,果蝇的寿命与rBTI质量浓度呈现正相关。抗氧化酶活性检测发现,实验组果蝇体内的SOD和CAT活性均显著升高。rBTI延缓果蝇衰老的作用可能是通过刺激机体的氧化应激能力来实现的。

rBTI联合紫杉醇通过激活NFκB/p65促进MCF-7细胞凋亡

rBTI、紫杉醇均有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡等作用,但两者联合用药对肿瘤细胞的影响尚不明确.本文通过MTT比色法检测rBTI与紫杉醇联合作用对MCF-7细胞增殖的影响;采用流式细胞术分析,对MCF-7细胞凋亡以及ROS水平进行检测;利用qRT-PCR和Western印迹方法,检测rBTI与紫杉醇联合作用后凋亡因子表达情况.结果表明,rBTI（2.5μmol/L）与紫杉醇（0.05~0.5μmol/L）联合作用于MCF-7细胞后,能显著抑制其增殖.将rBTI与紫杉醇进行联合协同用药,诱导了MCF-7细胞凋亡及ROS的产生;同时与rBTI单独作用时相比,联合作用明显上调了p53、Bax的表达,促进了IκBα蛋白的磷酸化以及NFκB/p65的核转位;与rBTI组和紫杉醇单独作用组相比,两者联合用药明显下调了Bcl-2和CyclinD1的表达.本研究证实,rBTI联合紫杉醇通过诱导ROS的产生,激活NFκB/p65信号转导途径,协同促进MCF-7细胞的凋亡.

rBTI对鲈鱼鱼糜凝胶特性的影响

内源酶活性对食品的安全及品质有重要影响,抑制及灭活酶技术是食品研究的一个热点。为了探究蛋白酶抑制剂对鱼糜凝胶特性的影响,该研究以重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI)为材料,测定不同添加量rBTI(0.02‰~0.12‰)对鲈鱼鱼糜凝胶蒸煮损失率、色泽、强度等的影响,以明确rBTI对鱼糜凝胶的改善作用,并进一步研究rBTI对鱼糜凝胶蛋白含量及组成的影响,解析rBTI促进鱼糜凝胶稳定的分子机制。结果表明,与对照组相比,r BTI的添加对鱼糜凝胶白度无显著影响(P>0.05);随着r BTI添加量的增加,鱼糜凝胶的蒸煮损失率显著降低(P<0.05),凝胶穿刺力和凝胶强度显著升高(P<0.05)。鱼糜凝胶的黏附性随rBTI添加量的增加呈先降低后升高趋势,在r BTI添加量为0.04‰时达到最低值。随着rBTI添加量的增多,鱼糜凝胶中三氯乙酸-溶解肽含量显著下降(P<0.05)。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示,与对照组相比,添加rBTI后鱼糜凝胶中肌球蛋白重链及肌动蛋白等重要凝胶蛋白组分含量明显增加。研究表明rBTI可以抑制内源酶对鱼糜凝胶中蛋白分子的降解,有利于维持凝胶分子结构的稳定,进而改善鱼糜凝胶的质构性能,为rBTI的应用及肉制品的开发提供了理论依据。

pEGFP-N1介导BTI的表达抑制肝癌HepG2细胞迁移及细胞周期进程

荞麦是一种药食同源的粮食作物,研究发现荞麦胰蛋白酶抑制剂(BTI)可以抑制肿瘤细胞的增殖。该文采用激光共聚焦显微镜、MTT法、划痕法、流式细胞术、qRT-PCR、Western blot等方法检测了pEGFP-N1介导的BTI在HepG2细胞内的表达对细胞的生长、黏附、迁移、凋亡及细胞周期的作用。结果显示,pEGFP-N1介导的BTI在HepG2细胞内的表达显著抑制了细胞生长、黏附和迁移,并使HepG2细胞凋亡率增加。同时E-钙黏蛋白的表达水平增高,MMP-2和MMP-9的表达下降。伴随着p53、p21、p63、p73的上调表达,周期蛋白CyclinD1、CyclinE1和周期依赖性激酶(CDK2、CDK4、CDK7)的表达下调,细胞周期阻滞在G1期。